近年来,国内外产科病人应用椎管内麻醉进行剖宫产手术麻醉、分娩镇痛和术后止痛的比率逐年增加,但是临床工作中发现,部分产妇应用椎管内麻醉后发生神经系统并发症。国外近几年报道,普通人群椎管内麻醉后严重的神经系统并发症的发病率约为0.01%～0.05%,而产妇为0.58%～0.92%。根据现有报道资料分析,其产生原因可能为：①麻醉相关因素：麻醉穿刺等操作过程中损伤中轴神经或脊髓；局部麻醉药神经毒性损伤；硬膜外腔血肿或感染等；②产科相关因素：产妇分娩或剖宫产体位压迫、牵拉神经,胎儿等机械性因素压迫产道；③其它因素：体位、血管收缩药物、污染以及原因不明等。但其发生是由其中某一因素所决定,或为多种因素相互作用的结果目前仍尚不明了。其中,妊娠分娩期间局部麻醉药阻滞效能敏感性和神经毒性是否改变成为麻醉学与疼痛治疗学领域关注的重点。关于妊娠分娩期间局部麻醉药阻滞效能敏感性和神经毒性的研究存在很大争议。综合文献报道,神经电生理学方面研究认为妊娠与分娩增加局部麻醉药的中枢、中轴、周围神经的阻滞效能敏感性和神经毒性作用,因而减少对此类药物的需要量。但也有少数研究者提出异议,他们认为妊娠只是引起扩散屏障和内源性镇痛系统的变化,而脊髓神经根轴突的电生理特性没有改变。而此后在椎管内麻醉后所致神经系统并发症的调查发现,暂时性神经病学综合征(transient neurological syndrome, TNS)在产妇中的发病率报道差异很大(0.015%～8.8%),并认为有关分娩镇痛或剖宫产麻醉所致TNS的发生率与多种因素相关,局部麻醉药的神经毒性作用公为其中因素之一,如排除其它因素,分娩镇痛或剖宫产麻醉后TNS的发生率并不高于非妊娠或分娩者。籍此可认为,目前尚无充分的病例或动物随机对照研究及大样本调查轻易对两种不同观念予以否定或肯定,有待进一步深入研究与探讨,方能得到具有充分说服力的证据。研究认为局部麻醉药脊神经毒性损伤机理与细胞凋亡有关。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族(cysteinyl aspartate specific protease, caspase)是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶。目前认为活化caspase的途径主要有两条信号转导通路：死亡受体通路系指细胞表面的死亡受体通过其细胞外结构域与相应的死亡配体结合,将细胞外凋亡信号传人细胞内,激活caspase-8基因,而后激活下游的caspase-3基因,最终启动细胞凋亡；线粒体通路则指氧自由基、钙超载等凋亡刺激因素使线粒体通透性增加,线粒体跨膜电位下降,释放细胞色素C,后者激活caspase-9基因和下游的caspase-3基因,诱导细胞发生凋亡。死亡受体通路和线粒体通路分别以caspase-8和caspase-9基因的激活为特征。细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶类和信号转导途径调控的“瀑布式”激活过程,鞘内注入布比卡因后脊神经细胞的凋亡及其信号转导机制是我们研究的主要方向。产妇不同于一般病人,对多数产妇而言,妊娠分娩是正常的生理过程,减少和避免产后并发症、尤其是神经系统并发症的发生,对提高产妇产后生活质量,显得尤为重要。目前关于局部麻醉药神经毒性损伤防治的研究尚未取得确切效果。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是中药黄芪的主要有效成分之一,其不但具有清除自由基、抵抗脂质过氧化反应,有效减轻神经细胞的凋亡的作用,而且还可以通过激活细胞免疫,升高IL-1β水平而促进脊神经损伤后的修复,对脊神经再生有一定作用。黄芪多糖能否减轻布比卡因的脊神经毒性损伤反应目前暂未见研究报道。牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液(Extract from rabbit skin inflamed byvaccinia virus for injection)是用牛痘疫苗接种家兔皮肤,将发生炎症反应的皮肤组织进行提纯后得到的非蛋白性生物活性物质,具有镇痛、免疫调节、改善植物神经功能、促进神经轴突生长、促进雪旺细胞繁殖、拮抗缺氧缺血造成的神经细胞损伤、拮抗谷氨酸等毒性物质造成的神经细胞损伤等作用。牛痘疫苗致炎兔皮提取物能否减轻鞘内注入布比卡因的脊神经毒性损伤反应也未见研究报道。本研究通过制备孕鼠鞘内注入布比卡因的模型,探讨妊娠分娩期间局部麻醉药阻滞效能敏感性和神经毒性是否改变,鞘内注入布比卡因导致神经细胞凋亡的信号转导通路,以及黄芪多糖和牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液预先给药对布比卡因脊神经毒性的保护作用,为药物防治妊娠分娩期间局部麻醉药神经毒性损伤提供一定实验依据。第一部分鞘内注入布比卡因对孕鼠神经功能及背根神经节细胞caspase-8和caspase-9基因的影响目的比较孕鼠和非孕鼠鞘内注入布比卡因对神经功能及背根神经节细胞caspase-9和caspase-8基因表达的影响,探讨妊娠分娩期间脊神经对布比卡因的阻滞效能敏感性是否改变及其机制。方法健康妊娠17日及非孕雌性SD大鼠,取鞘内置管成功的两种鼠各18只,孕鼠体重350～400g,非孕鼠体重200～220g,完全随机方法分成6组(n=6)。孕鼠对照组(PN组)与2%布比卡因孕鼠组(P2B组)及4%布比卡因孕鼠组(P4B组)：非孕鼠对照组(N组)与2%布比卡因非孕鼠组(2B组)及4%布比卡因非孕鼠组(4B组)。PN与N组：鞘内注射生理盐水30μl,其余4组相应鞘内分别注入2%或4%布比卡因30μl。鞘内注药后10min、20min、30min、1h、2h、4h、1d、2d、3d和4d测定甩尾反应潜伏期TFL,用最大效应百分比MPE表示,并进行下肢运动功能MF评分。4d后各组大鼠行断颈处死,分离背根神经节,Western blot分析caspase-8和caspase-9蛋白表达水平以及RT-PCR检测caspase-8和caspase-9mRNA的表达。采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,置管前后TFL组间比较采用单因素方差分析,置管前后的比较采用配对t检验。MPE值比较采用重复测量设计的方差分析。caspase-8,9蛋白和mRNA表达比较采用单因素方差分析,多重比较采用Bonferroni法(方差齐)或DunnettT3法(方差不齐)。运动功能评分以中位数(第10,90位点百分位数)表示,多组比较采用Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组大鼠鞘内注药后MPE的比较。显示组间大鼠MPE存在差异(F=72.845,P=0.000),注药后MPE随时间发生显著变化(F=100.134,P=0.000),而且分组与时间之间存在交互作用(F=13.386,P=0.000),说明各组之间的差异在不同时间点不一样,故有必要对每一时间点分别比较组间的差别；进一步进行单独效应分析发现：10min-2h之间,2B组、4B组、P2B组和P4B组MPE均高于N组和PN组(P<0.05),在4h时点,4B组、P2B组和P4B组MPE均高于N组、PN组和2B组(P<0.05),而P2B组和P4B组MPE也高于2B组(P<0.05),在1h时点,P2B组和P4B组MPE均高于N组、PN组、2B组和4B组(P<0.05),而P4B组MPE高于P2B组(P<0.05)；各组内的不同时点进行比较,2B组、4B组、P2B组和P4B组MPE在鞘内注药后10min均达到高峰后呈下降趋势,2B组和4B组分别于4h和1d恢复至基线水平,而P2B组和P4B组则于2d方恢复至基线水平。2.各组大鼠鞘内注药后MF评分的比较。鞘内注药后10min-4h各组大鼠的运动功能有显著差异,根据平均秩次进一步推断,2B,4B,P2B和P4B组MF评分较N组与PN组均明显升高,在10min-20min P4B组、P2B组和4B组MF评分最高,2B组其次：在30min和2h,P4B组和P2B组MF评分最高,4B组和2B组其次；在1h,P4B组、P2B组、4B组和2B组MF评分依次降低；在4h,P4B组MF评分最高,P2B组其次。3.各组大鼠背根神经节内caspase-8和caspase-9蛋白表达水平的比较。与N组和PN组比较,2B组,4B组,P2B组和P4B组caspase-9蛋白表达均上调(P<0.05)。4.各组大鼠背根神经节内caspase-8和caspase-9mRNA表达水平的比较。与N组和PN组比较,2B组,4B组,P2B组和P4B组caspase-9mRNA表达均上调(P<0.05)。结论妊娠期间孕鼠背根神经节细胞对布比卡因的阻滞效能敏感性增大。鞘内注入相同浓度和剂量布比卡因,孕鼠感觉、运动神经阻滞持续时间明显长于非孕鼠。布比卡因是通过线粒体通路活化caspase-9基因诱导大鼠背根神经节细胞发生凋亡。第二部分多次鞘内注入布比卡因对孕鼠神经功能及背根神经节细胞凋亡的影响目的比较孕鼠和非孕鼠多次鞘内注入布比卡因对神经功能及背根神经节细胞凋亡的影响,探讨妊娠分娩期间布比卡因脊神经毒性是否改变及其机制。方法健康妊娠17日及非孕雌性SD大鼠,取鞘内置管成功的两种鼠各12只,孕鼠体重350-400g,非孕鼠体重200-220g,完全随机方法分成4组(n=6)。孕鼠2%布比卡因(P2B组)和非孕鼠2%布比卡因组(2B组)鞘内分别注入2%布比卡因30μl,20μl和10μl,共3次,每次间隔1h；孕鼠对照组(PN组)和非孕鼠对照组(N组)鞘内分别注入相同体积的生理盐水。在第3次鞘内注药后1d、2d、3d、4d和5d测定TFL,用最大效应百分比MPE表示,并进行下肢运动功能MF评分。5d后多聚甲醛灌注,分离背根神经节,进行病理组织学观察,TUNEL法检测背根神经节细胞凋亡情况以及免疫组织化学法检测caspase-9蛋白表达。采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,置管前后TFL组间比较采用单因素方差分析,置管前后比较采用配对t检验。MPE值比较采用重复测量设计的方差分析。凋亡细胞计数和caspase-8,9阳性细胞计数比较采用单因素方差分析,多重比较采用Bonferroni法(方差齐)或Dunnett T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组大鼠多次鞘内注药后MPE的比较。显示组间大鼠MPE存在差异(F=19.089,P=0.000),组间多重比较,除N组和PN组之间无显著差异外(P=0.931),其余各组间均有显著差异(P<0.01)；注药后MPE随时间发生显著变化(F=3.124,P=0.043),2B组大鼠MPE在鞘内注药后2d达高峰,然后呈下降趋势,而P2B组大鼠MPE在鞘内注药后持续增高；分组与时间之间无交互作用(F=1.896,P=0.087)。2.各组大鼠鞘内注药后MF评分的比较。所有大鼠运动功能未受影响,鞘内注药后MF评分均为0分。3.病理组织学观察结果。2B组有部分神经细胞萎缩、空泡化。与2B组比较,P2B组神经细胞萎缩、空泡化数量明显增加。4.各组大鼠背根神经节细胞凋亡数量的比较。与N组、PN组和2B组比较,P2B组凋亡细胞数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。5.各组大鼠背根神经节细胞caspase-9阳性细胞数量的比较。与N组和PN组比较,2B组和P2B组caspase-9阳性细胞数量均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论妊娠分娩期间布比卡因对大鼠背根神经节细胞的毒性增大,多次鞘内注入相同浓度和剂量布比卡因后,孕鼠出现明显的感觉功能障碍和神经细胞损害,而运动功能未受影响,其背根神经节细胞凋亡与caspase-9基因大量活化密切相关。第三部分黄芪多糖预先给药对孕鼠鞘内注入布比卡因脊神经毒性的影响目的探讨黄芪多糖预先给药是否可以减轻孕鼠鞘内注入布比卡因的脊神经毒性及其机制。方法取鞘内置管成功健康妊娠17日孕鼠30只,完全随机方法分成5组(n=6)。对照组(N组),2%布比卡因单次给药组(2B组),2%布比卡因单次给药黄芪多糖预处理组(2H组),2%布比卡因多次给药组(R2B组),2%布比卡因多次给药黄芪多糖预处理组(R2H组)。N组：鞘内注射生理盐水30μl,腹腔注入生理盐水2ml。2B组：鞘内注入2%布比卡因30μl,腹腔注入生理盐水2ml。R2B组：鞘内分别注入2%布比卡因30μl,20μl和10μl,共3次,每次间隔1h,腹腔注入生理盐水2ml。2H组：鞘内注入2%布比卡因30μl,腹腔注入黄芪多糖2ml。R2H组：鞘内分别注入2%布比卡因30μl,20 u l和10μl,共3次,每次间隔1h,腹腔注入黄芪多糖2ml。黄芪多糖给药方法为：25mg／kg,生理盐水稀释成2ml,于鞘内给药前连续注药3天,鞘内给药后连续注药4天。在第3次鞘内注药后1d、2d、3d、4d和5d测定TFL,用最大效应百分比MPE表示,并进行下肢运动功能MF评分。5d后多聚甲醛灌注,分离背根神经节,进行病理组织学观察,TUNEL法检测背根神经节细胞凋亡情况以及免疫组织化学法检测caspase-9蛋白表达。采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,置管前后TFL组间比较采用单因素方差分析,置管前后比较采用配对t检验。MPE值比较采用重复测量设计的方差分析。凋亡细胞计数和caspase-9阳性细胞计数比较采用单因素方差分析,多重比较采用Bonferroni法(方差齐)或DunnettT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组大鼠鞘内注药后MPE的比较。显示组间大鼠MPE存在差异(F=20.022,P=0.000),注药后MPE随时间未发生显著变化(F=0.823,P=0.459),而且分组与时间之间存在交互作用(F=3.190,P=0.003)。说明各组之间的差异在不同时间点不一样,故有必要对每一时间点分别比较组间的差别：进一步进行单独效应分析发现：在1d时点,2B组和R2B组MPE高于N组(P<0.05),在2d-5d之间R2B组MPE高于N组和2H组(P<0.05),在2d,3d和5d R2B组MPE高于2B组(P<0.05),在2d和5d R2B组MPE高于R2H组(P<0.05);各组内的不同时点进行比较,2B、2H和R2H组大鼠MPE在鞘内注药后1d达高峰,然后呈下降趋势,而R2B组大鼠MPE在鞘内注药后持续增高。2.各组大鼠鞘内注药后MF评分的比较。所有大鼠运动功能未受影响,鞘内注药后MF评分均为0分。3.病理组织学观察结果。2H组仅有少量神经细胞萎缩空泡化,2B组和R2H组有部分神经细胞萎缩、空泡化。与R2H组比较,R2B组神经细胞萎缩、空泡化数量明显增加。4.各组大鼠背根神经节细胞凋亡数量比较。与N组、2B组、2H和R2H组比较,R2B组凋亡细胞数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。5.各组大鼠背根神经节细胞caspase-9阳性细胞数量的比较。与N组、2B组、2H和R2H组比较,R2B组caspase-9阳性细胞数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论预先给予黄芪多糖可以减轻孕鼠鞘内注入布比卡因的脊神经毒性,其机制可能与抑制caspase-9蛋白表达,抗神经细胞凋亡有关。第四部分牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液预先给药对孕鼠鞘内注入布比卡因脊神经毒性的影响目的探讨牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液预先给药是否可以减轻孕鼠鞘内注入布比卡因的脊神经毒性及其机制。方法取鞘内置管成功孕鼠18只,完全随机方法分成3组(n=6)。对照组(N组),2%布比卡因多次给药组(R2B组),2%布比卡因多次给药AGC预处理组(R2A组)。N组：鞘内注射生理盐水30μl,20μl和10μl,共3次,每次间隔1h,腹腔注入生理盐水。R2B组：鞘内分别注入2%布比卡因30μl,20μl和10μl,共3次,每次间隔1h,腹腔注入生理盐水。R2A组：鞘内分别注入2%布比卡因30μl,20 u l和10μl,共3次,每次间隔1h,腹腔注入AGC。各组鞘内注药完毕后,用10μl生理盐水冲洗导管。AGC给药方法为：AGC稀释液(10u／ml),按100u／kg,于鞘内给药前连续注药3天,鞘内给药后连续注药4天。其余组腹腔注入等体积生理盐水(10ml／kg)。在第3次鞘内注药后1d、2d、3d、4d和5d测定TFL,用最大效应百分比MPE表示,并进行下肢运动功能MF评分。5d后多聚甲醛灌注,分离背根神经节,进行病理组织学观察, TUNEL法检测背根神经节细胞凋亡情况以及免疫组织化学法检测caspase-9蛋白表达。采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,置管前后TFL组间比较采用单因素方差分析,置管前后比较采用配对t检验。MPE值比较采用重复测量设计的方差分析。凋亡细胞计数和caspase-9阳性细胞计数比较采用单因素方差分析,多重比较采用Bonferroni法(方差齐)或DunnettT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组大鼠鞘内注药后MPE的比较。显示组间大鼠MPE存在差异(F=22.329,P=0.000),注药后MPE随时间未发生显著变化(F=1.569,P=0.229),而且分组与时间之间存在交互作用(F=3.182,P=0.038)。说明各组之间的差异在不同时间点不一样,故有必要对每一时间点分别比较组间的差别；进一步进行单独效应分析发现：在1d时点,R2B组和R2A组MPE高于N组(P<0.05),在2d-5d之间R2B组MPE高于N组和R2A组(P<0.05),在2d和3d R2A组MPE高于N组(P<0.05)；各组内的不同时点进行比较, R2A组大鼠MPE在鞘内注药后1d达高峰,然后呈下降趋势,而R2B组大鼠MPE在鞘内注药后持续增高。2.各组大鼠鞘内注药后MF评分的比较。所有大鼠运动功能未受影响,鞘内注药后MF评分均为0分。3.病理组织学观察结果。R2A组有部分神经细胞萎缩、空泡化。与N组和R2A组比较,R2B组神经细胞萎缩、空泡化数量明显增加。4.各组大鼠背根神经节细胞凋亡数量比较。与N组和R2A组比较,R2B组凋亡细胞数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。5.各组大鼠背根神经节细胞caspase-9阳性细胞数量的比较。与N组和R2A组比较,R2B组caspase-9阳性细胞数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),。结论预先给予牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液可以减轻孕鼠鞘内注入布比卡因的脊神经毒性,其机制可能与抑制caspase-9蛋白表达,抗神经细胞凋亡有关。