论文部分内容阅读
目的 分析泰索帝对人鼻咽癌细胞系CNE-1的放射增敏作用是否与改变细胞周期分布有关，并观察其是否能够诱导CNE-1细胞凋亡。 材料与方法 1．细胞系及培养方法：人鼻咽癌细胞系CNE-1（购自中国预防医学科学院病毒研究所）。在5％CO2、100％湿度、37℃恒温箱内，用含10％新生小牛血清的PRMI 1640培养液（美国GIBCO BRL公司产品），将CNE-1细胞接种于培养瓶内单层传代培养。取指数生长期细胞进行实验。 2．药物及照射方法：实验前将泰索帝（AVENTIS公司产品）用PRMI 1640培养液配制成所需的浓度5×10-8mg／ml。采用SIEMENS公司的PRIMUS直线加速器6MV X线进行照射，SSD=100cm，剂量率为200cGy／min，射野40×40cm。 3．流式细胞分析：取指数生长期细胞，胰酶消化计数活细胞数，按一定数量接种于培养瓶内，贴壁培养12h后，去除培养液。 （1）对照组：加入不含药物的新鲜培养液（4ml）培养12h；再次换新鲜培养液（4ml）； （2）单纯用药组：加入含泰索帝(5×10-8mg／ml)的培养液（4ml）作用12h后弃去含药培养液，用PBS液清洗2次，加新鲜培养液（4ml）； （3）单纯照射组：加入不含药物的新鲜培养液（4ml）培养12h，再次换新鲜培养液NInl人然后立即进行单次照射2 Gy； N)泰索帝加照射组：加人含泰索帝O x 10一 m旷ml)的培养液Nml)作用12h后弃去合药培养液，用PBS液清洗2次，加新鲜培养液NInlX随后立即进行单次照射2 Gy。 上述各组细胞经处理后继续培养0为、12、18、24J6／8h，分别胰酶消化、收获细胞，－20℃预冷的 70％乙醇4t固定至少0·sh。检测前弃乙醇，依次用 0．1％Tion X－100 IInl＊RNase 200…J0Pg／Inl PI染液 100gi处理后，用流式细胞仪（FACScan）激发光波长 488run。每个样品至少检测 lx 10‘个细胞，数据获取用 CELLQuest软件，分析细胞周期用 ModF’t 2．0软件。 4．免疫组化染色：将盖玻片置于 6cm直径的玻璃培养皿内，每只培养皿内放置两个盖玻片。取指数生长期细胞，胰酶消化计数活细胞数，按一定数量滴加单细胞悬液于盖玻片上，盖上培养皿上盖。贴壁培养约半小时后，向培养皿内加人4Inl培养液，继续培养12h后去除培养液。 O)对照组：加人不含药物的新鲜培养液kInl)培养12h；再次加新鲜培养液KInlh K)用药组：加人含泰索帝O X 10－‘mgilnl)的培养液NInl)作用12h后弃去含药培养液，用PBS液清洗2次，换新鲜培养液（4ml）； 橱)上述各组细胞经处理后继续培养48h，取出盖玻片，PBS液清洗 3次（x smin人用 95％乙醇固定 10ndn，PBS液清洗 3次（x sndn）。 O）将盖玻片置于 0．二％的 Triton X－100溶液内浸 20ndn，PBS液清洗 3次(x 5 dn人以后步骤按免疫组化试剂盒说明书进行。 采用S－P法，一抗为即用型。兔抗人CasPase－Pn多克隆 ·2·抗体（MB－0303，oL NO：20526303A）、鼠抗人h－2单克隆抗体（MAB－0014，nt．NO：11224014C）及 S－P检测试剂盒（KIT－97 10，oL N…021）均为福州迈新生物技术开发公司产品。 5．数据及图片处理：使用统计学软件SPSS10．0绘制图表。免疫组化结果显微照像摄片。 结 果 与对照组比较，5 x 10一 m砂ml泰索帝或二句 X线照射，均能使 CNE一细胞 G。＋M期阻滞，而H者联合应用时对 G。＋M期阻滞则有协同作用。随去除处理因素后的时间延长，G。＋M期细胞百分比逐渐增加，并于去除处理因素18h以后，该效果愈来愈明显。 不同因素处理后0为、12、18上4、36／8h，各处理因素诱导＊＊E一细胞凋亡作用强度的顺序为：泰索帝十照射＞泰索帝或照射＞对照。随着时间的增加，凋亡率逐渐增加，并于去除处理因素18h后趋于明显。 与对照组比较，去除处理因素后48h，泰索帝组促凋亡蛋白CasPase－Pan阳性表达增强，而抗凋亡蛋白h一二阳性表达减弱。 结 论 泰索帝可使人鼻咽癌细胞系 CNE一豆细胞发生 Gi＋M期阻滞，并能够诱导人鼻咽癌细胞系CNE一细胞的凋亡，可能是其对CNE一细胞放射增敏的重要机制。