目前以肿瘤免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已经成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式,研究和开发新型肿瘤疫苗已经成为近年国际上肿瘤免疫治疗的热点之一。在目前已知的众多肿瘤相关抗原中,癌睾丸抗原(cancer/testis Antigen, CTA)有其特异的表达模式,即在各种肿瘤组织中有不同频率的表达,而在正常组织中仅在睾丸生殖细胞中表达,偶然在胎盘中表达。但睾丸是免疫豁免器官,不引起机体特异性免疫反应。因此,CTA适于作为特异性肿瘤免疫治疗的靶抗原。作为CTA亚家族的黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene, MAGE)是从黑色素瘤细胞中分离出来的一大家族抗原基因,其编码的肿瘤排斥抗原在细胞内经加工产生抗原肽,并与HLA-I类分子结合形成复合物,能够被自体细胞毒性T细胞识别,诱导出对相应肿瘤细胞的特异性杀伤。MAGE基因在许多肿瘤组织中有较高的表达,但在正常组织(除睾丸和胚胎外)均不表达,因此可作为CTL介导肿瘤特异性免疫治疗的理想靶分子。深入研究MAGE基因的功能将会为开展肿瘤分子学诊断和肿瘤免疫治疗的临床应用奠定良好的基础。有研究提示,MAGE-A4可能表现了与该家族中其它成员不同的分子生物学特性,但是其具体的生物学功能和分子机制到目前还不十分清楚。本研究采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测了MAGE-A4 mRNA在77例乳腺癌良恶性组织及乳腺癌细胞系中的表达;构建了同时表达MAGE-A4和FLAG标签的表达载体FLAG-pcDNA3-MAGE-A4,并通过MTT分析和克隆形成实验研究了MAGE-A4过表达对MAGE-A4低表达的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响;采用荧光素酶报告基因分析、RT-PCR、Western-blot、克隆形成实验和TUNEL染色法检测了MAGE-A4对p53转录活性的影响;采用细胞质与细胞核分离实验检测了MAGE-A4在细胞中的定位;采用免疫荧光染色技术检测了MAGE-A4与p73蛋白在细胞中的共定位;采用免疫共沉淀技术检测了MAGE-A4与p53家族成员之间的物理性结合;利用siRNA技术研究了抑制MAGE-A4基因对高表达MAGE-A4的乳腺癌细胞系凋亡的影响。主要研究内容和结果如下:第一部分:肿瘤抗原MAGE-A4在乳腺癌组织和细胞系中的表达目的:通过检测MAGE-A4在乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织及六种乳腺癌细胞系中的表达,探讨其表达与乳腺癌临床指标及生物学行为的关系方法:采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术从转录水平上检测MAGE-A4在乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织及六种乳腺癌细胞系中的表达,并回顾性分析其表达与乳腺癌临床指标与生物学行为(包括患者年龄、肿瘤大小、TNM分期、病理类型、组织学分级、腋淋巴结转移状况、有否脉管瘤栓、ER/PR和HER-2表达)的关系。结果:1. 77例乳腺正常组织中均未发现MAGE-A4 mRNA的表达;77例乳腺癌旁组织中有4例MAGE-A4 mRNA表达阳性,阳性率为5.19%;77例乳腺癌组织中有33例MAGE-A4 mRNA表达阳性,阳性率为42.9%。2. MAGE-A4 mRNA的表达与乳腺癌患者临床指标及生物学行为的关系25例60及60岁以上的乳腺癌患者中有15例MAGE-A4 mRNA表达阳性,阳性率为60%,52例60岁以下的乳腺癌患者中有18例MAGE-A4 mRNA表达阳性,阳性率为34.6%,两者之间有统计学差异(χ~2=4.442,p=0.035);MAGE-A4 mRNA表达与其它临床指标及生物学行为包括临床分期(χ~2=0.421,p=0.517)、肿瘤大小(χ~2=2.301,p=0.316)、病理类型(χ~2=1.820,p=0.402)、组织学分级(χ~2=0.229,p=0.892)、淋巴结转移(χ~2=5.707,p=0.058)、脉管瘤栓(χ~2=0.000,p=1.000)、ER/PR表达(χ~2=0.040,p=0.980)及HER-2表达(χ~2=0.090,p=0.764)之间均没有显著相关性。3. MAGE-A4 mRNA在六种乳腺癌细胞系中的表达乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB-453和MDA-MB-468中MAGE-A4 mRNA表达均为阴性;乳腺癌细胞系MDA-MB-436中MAGE-A4 mRNA高表达。结论:1.正常乳腺组织中无MAGE-A4 mRNA表达;乳腺癌旁组织中MAGE-A4 mRNA表达阳性率为5.19%;乳腺癌组织中MAGE-A4 mRNA表达阳性率为42.9%。提示MAGE-A4可作为肿瘤特异性抗原。2. MAGE-A4 mRNA表达与乳腺癌患者的肿瘤大小、临床分期、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、脉管瘤栓、ER/PR及HER-2状态无明显相关性(p>0.05),但与患者的年龄存在明显的相关性。60岁以上乳腺癌患者肿瘤组织中MAGE-A4mRNA表达阳性率明显高于60岁以下乳腺癌患者(p<0.05)。3.六种乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB-453和MDA-MB-468中均无MAGE-A4 mRNA表达;MDA-MB-436中MAGE-A4 mRNA呈高表达。第二部分:FLAG-pcDNA3-MAGE-A4表达载体的构建及功能分析目的:构建带有FLAG标签的MAGE-A4基因表达载体,并研究其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:利用巢式PCR及基因重组技术构建带有FLAG标签的MAGE-A4基因表达载体FLAG-pcDNA3-MAGE-A4,并通过克隆形成实验和MTT法研究MAGE-A4过表达对MAGE-A4低表达的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。结果:1.成功构建了MAGE-A4基因表达载体FLAG-pcDNA3-MAGE-A4,并在体外获得良好的表达。2.克隆形成实验结果显示,转染MAGE-A4基因,并经G418筛选两周后,MCF-7细胞克隆形成数为2±0,明显低于对照组(25±2)(p<0.05);MDA-MB-231细胞克隆形成数为22±2,均明显低于对照组(104±5)(p<0.05)。3. MTT法分析结果显示,MCF-7细胞转染MAGE-A4基因后,经阿霉素(1μM)分别处理24小时和48小时,细胞的生存率分别为28.56%和14.65%;与转染空载体的对照组细胞(42.55%和29.74%)相比细胞存活细胞率显著下降;MDA-MB-231细胞转染MAGE-A4基因后,经阿霉素(1μM)分别处理24小时和48小时,细胞的生存率分别为69.49%和20.63%;与转染空载体的对照组细胞(68.57%和21.85%)相比细胞存活细胞率没有明显变化。结论:1.成功构建了MAGE-A4基因表达载体FLAG-pcDNA3-MAGE-A4,并且构建好的载体在体外表达阳性。2.外源性MAGE-A4可以抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖。3.外源性MAGE-A4增加了阿霉素诱导的MCF-7细胞的死亡率;但对MDA-MB-231细胞没有显著影响。第三部分:MAGE-A4与p53家族之间关系的研究目的:研究MAGE-A4对p53转录活性的影响,MAGE-A4是否与p53家族成员之间存在直接的物理结合,进而证实MAGE-A4的功能发挥是否部分或全部通过p53通路而完成。方法:采用荧光素酶报告基因分析、RT-PCR、Western-blot、克隆形成实验和TUNEL染色法检测MAGE-A4对p53转录活性的影响;采用细胞质与细胞核分离实验检测MAGE-A4在细胞中的定位;采用免疫荧光染色技术检测MAGE-A4与p73蛋白在细胞中的共定位;采用免疫共沉淀技术检测MAGE-A4与p53家族成员之间的物理性结合。结果:1. MAGE-A4对p21WAF1启动子介导的荧光素酶表达的影响在H1299细胞系中,对照组的荧光素酶活性为1±0.00;单独转染25ng pcDNA3-p53表达质粒组的荧光素酶活性为18.83±2.16,和内参照组相比明显增高(p<0.01);共转染恒定量(25ng)pcDNA3-p53表达质粒和逐渐增加量(100ng、200ng、400ng)的FLAG-pcDNA3-MAGE-A4表达质粒之后,各组的荧光素酶活性分别为39.25±1.68、45.07±6.78和50.49±4.93,与内参照组相比均显著增高( p<0.01 );单独转染400ng FLAG-pcDNA3-MAGE-A4表达质粒组的荧光素酶活性为1.01±0.05,与内参照组相比无显著差异(p>0.05)。2. MAGE-A4对p21WAF1mRNA表达的影响在H1299细胞系中,单独转染p53基因之后,p21WAF1 mRNA的表达水平明显高于未转染组(p<0.01),共转染p53和MAGE-A4基因之后,p21WAF1 mRNA表达水平明显高于单独转染p53基因组(p<0.01)。3. MAGE-A4对p21WAF1蛋白表达的影响在H1299细胞系中,单独转染p53基因之后,p21WAF1蛋白表达水平明显高于未转染组(p<0.01),共转染p53和MAGE-A4基因之后,p21WAF1蛋白表达水平明显高于单独转染p53基因组(p<0.01)。4. MAGE-A4对H1299细胞克隆形成的影响克隆形成实验结果显示,在H1299细胞中,转染1μg空载体,G418抗性的细胞克隆数为96±3,转染0.5μg pcDNA3-p53表达载体之后,G418抗性的细胞克隆数为47±2,共转染0.5μg pcDNA3-p53和0.5μg FLAG-pcDNA3-MAGE-A4表达载体之后,G418抗性的细胞克隆数为15±1,三组G418抗性的细胞克隆数之间均有统计学差异(p<0.01)。5. MAGE-A4对H1299细胞凋亡的影响TUNEL染色结果显示,在H1299细胞系中转染1μg空载体48h后,凋亡细胞率为1%,转染0.5μg pcDNA3-p53 48h后,凋亡细胞率为6.8%,共转染0.5μg pcDNA3-p53和0.5μg FLAG-pcDNA3-MAGE-A4 48h后,凋亡细胞率为19.3%,三组均数之间均有统计学差异(p<0.01)。6. MAGE-A4在细胞中的定位细胞质与细胞核分离实验结果证实,在H1299细胞中,外源性MAGE-A4在细胞质和细胞核均有表达。7. MAGE-A4与p73在细胞中的共定位免疫荧光染色实验结果证实,在H1299细胞中,p73蛋白定位于细胞核中;部分MAGE-A4定位于细胞质,部分则定位于细胞核;p73和MAGE-A4在细胞核中存在共定位现象。8. MAGE-A4与p53之间的物理性结合在H1299细胞中共转染p53和MAGE-A4表达载体之后,免疫共沉淀分析结果显示,p53的免疫沉淀物中含有MAGE-A4;反之,MAGE-A4的免疫沉淀物中也含有p53。9. MAGE-A4与p73之间的物理性结合在H1299细胞中共转染p73和MAGE-A4表达载体之后,免疫共沉淀分析结果显示,p73的免疫沉淀物中含有MAGE-A4;反之, MAGE-A4的免疫沉淀物中也含有p73。结论:1. MAGE-A4可以增加p53的转录活性。2. MAGE-A4可以通过增加p53转录活性而产生抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的功能。3. MAGE-A4在细胞质和细胞核中均有表达。4. p73和MAGE-A4在细胞核中存在共定位。5. p53和MAGE-A4蛋白之间以及p73和MAGE-A4蛋白之间均存在物理性结合。MAGE-A4蛋白通过和p53家族成员之间的直接结合而发挥生物学功能。第四部分:MAGE-A4 siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-436凋亡的影响目的:检测靶向MAGE-A4 siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-436凋亡的影响。方法:采用MAGE-A4 siRNA转染抑制乳腺癌细胞MDA-MB-436中MAGE-A4的表达,然后使用顺铂诱导细胞凋亡,利用TUNEL染色法、流式细胞分析技术及检测PARP蛋白裂解来分析MAGE-A4 siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-436凋亡的影响。结果:1.靶向MAGE-A4 siRNA转染对MDA-MB-436细胞中MAGE-A4 mRNA的抑制效率靶向MAGE-A4 siRNA转染MDA-MB-436细胞48h后,MAGE-A4 mRNA的表达与阴性对照组相比明显下调。转染30pmol MAGE-A4 siRNA与转染60pmol MAGE-A4 siRNA48h后,与阴性对照组相比其mRNA抑制率分别达到了87.5%与97.5%。2. MDA-MB-436细胞对化疗药物阿霉素和顺铂的敏感性MTT分析结果显示,MDA-MB-436细胞在阿霉素(1μM)分别处理24小时和48小时后细胞生存率分别为99.20%和98.62%;在顺铂(10μM)分别处理24小时和48小时后细胞生存率分别为79.44%和68.10%。3. TUNEL染色法分析靶向MAGE-A4 siRNA转染对顺铂处理后的MDA-MB-436细胞凋亡的影响TUNEL染色法结果显示,靶向MAGE-A4 siRNA转染MDA-MB-436细胞48h后,顺铂(10μmol/L)处理细胞12h和24h,凋亡细胞率分别为9.1%和2.2%,与阴性对照组(24.1%和10.0%)相比明显减少(P<0.05)。4.流式细胞技术分析靶向MAGE-A4 siRNA转染对顺铂处理后的MDA-MB-436细胞凋亡的影响流式细胞分析结果显示,靶向MAGE-A4 siRNA转染MDA-MB-436细胞48h后,顺铂(10μmol/L)处理细胞12h和24h,实验组subG1%((4.68±0.04)%)与对照组subG1%((10.88±0.11)%)相比显著下降(P<0.05)。5.通过检测PARP蛋白裂解分析靶向MAGE-A4 siRNA转染对顺铂处理后的MDA-MB-436细胞凋亡的影响Western blot结果显示,靶向MAGE-A4 siRNA转染MDA-MB-436细胞48h后,顺铂(10μmol/L)处理细胞12h和24h,细胞凋亡的核心成员caspase的酶切底物PARP蛋白均有不同程度的裂解。实验组裂解带的灰度值与actin灰度值的比值(0.129±0.014)与对照组(0.549±0.023)相比显著降低(P<0.05)。结论:1.靶向MAGE-A4 siRNA转染对MDA-MB-436细胞MAGE-A4表达有明显的抑制效果。2. MDA-MB-436对阿霉素耐药,而对顺铂较敏感。3.靶向MAGE-A4 siRNA转染可降低MDA-MB-436对CDDP诱导的凋亡,提示:MAGE-A4在一定程度上发挥肿瘤抑制因子的作用。