随着人口老龄化的迅速发展,衰老正在成为一个全球性的公共卫生问题。开发潜在的临床疗法和药物以延缓衰老和治疗衰老相关疾病已经成为热点研究方向。黄芪作为传统中药及药食同源的植物,具有广泛的生理药理作用,其生黄芪根和经蜂蜜炒制后的炙黄芪根都具有抗衰老的药理作用,但是其物质作用基础及机制尚不明确,且生黄芪和炙黄芪两者在抗衰老作用上的差异至今尚未明确。基于此,提出本课题研究,拟通过基于网络药理学、液质联用技术以及分子生物学等技术探讨生、炙黄芪抗衰老作用物质基础及其可能机制。本研究中,首先利用网络药理学以及分子对接对黄芪抗衰老的活性成分、作用靶点及通路进行了预测及验证,根据度值大小,预测黄芪抗衰老的主要活性成分可能为槲皮素,栀子醇,异鼠李素,3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚和山奈酚等,这些活性成分主要通过作用于Akt1,MAPK1,MAPK8,SIRT1,mTOR和CASP3等靶点,调节PI3K/Akt,MAPK,AMPK,Toll-like receptor等信号通路发挥抗衰老作用。然后通过MRM-UPLC-MS/MS技术对生黄芪和炙黄芪水提物的体外物质成分进行分析,从中检测出17种化合物,并根据黄芪甲苷的标准曲线计算了各个化合物的相对含量,结果表明炙黄芪中山奈酚、槲皮素、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮苷-6"-O-乙酸盐、芒柄花苷-6"-O-乙酸盐、芒柄花素、黄芪皂苷Ⅰ和棕榈酸含量较生黄芪均升高。而毛蕊异黄酮苷-6"-O-丙二酸酯、芒柄花苷、芒柄花苷-6"-O-丙二酸酯、毛蕊异黄酮、(6aR,11aR)-3-羟基-9,10-二甲氧基翼果烷、黄芪皂苷Ⅱ、大豆皂苷Ⅰ和亚麻酸含量均降低。说明生黄芪经蜂蜜炒制后,其组分的含量会相应地发生变化。通过UPLC-Q-TOF/MS对分别连续灌胃3天生黄芪和炙黄芪水提物的大鼠不同时间点的血清样品进行分析,总离子图结果揭示生、炙黄芪血清代谢轮廓之间峰形及峰强度存在一定的差异,说明生、炙黄芪入血后代谢存在差异。sPLS-DA图显示生、炙黄芪各自不同时间点的血清代谢物的组内聚集度较好,组间分离度较大,进一步说明其血清代谢物之间的差异且有潜在代谢生物标记物的生成。Loading图中的点距中轴线的距离表示对应特征值贡献度大小,距离越大贡献度越大,外围散落的点则是可能成为代谢生物标记物。结合HMDB数据库,从生黄芪血样中筛选出潜在生物标记物39种,鉴定了 10个入血成分,其中槲皮素原药入血。代谢通路主要为甘油磷脂代谢和花生四烯酸代谢。从炙黄芪血样中筛选出潜在生物标记物40种,鉴定了 17个入血成分,其中槲皮素原药入血。代谢通路主要为甘油磷脂代谢和原发性胆汁酸生物合成。这说明生黄芪和炙黄芪入血后的代谢差异可能是由花生四烯酸代谢和原发性胆汁酸生物合成引起的。最后,通过皮下注射D-半乳糖7周建立小鼠衰老模型,同时给予生黄芪、炙黄芪和槲皮素研究其对衰老小鼠的保护作用。小鼠共分为5组:空白组(Con组)、模型组(Model组)、生黄芪保护组(RA组)、炙黄芪保护组(RAP组)和槲皮素保护组(Quercetin组)。其中,槲皮素组只为验证槲皮素具有保护作用,不与生黄芪保护组和炙黄芪保护组做比较。具体研究如下:(1)D-半乳糖致衰老模型的验证建模7周后,采用Y-迷宫实验,通过自主交替率评价小鼠的空间记忆能力。结果表明,与Con组相比,Model组小鼠的自主交替率极显著降低(p<0.01),证明小鼠的空间学习记忆能力下降,也证明衰老模型建立成功。而RA、RAP和Quercetin保护组的自主交替率介于Con与Model组之间,且RAP组高于RA组,证明生、炙黄芪提取物和槲皮素确实具有抗衰老作用,且炙黄芪的抗衰老作用强于生黄芪。(2)生理指标的测定实验期间,5组小鼠体重均增加,但增加的速率不同。Model组与Con组相比,小鼠体重呈增加状态但速率却远低于Con组,说明随着致衰老时间的延长,体重逐渐下降。RA、RAP和Quercetin保护组小鼠体重增长速率介于Con组和Model组之间,说明给予生、炙黄芪提取物和槲皮素保护后可减缓体重下降趋势。计算小鼠的脑系数与肝脏系数,结果表明,与Con组相比,Model组小鼠的脑系数与肝脏系数均极显著降低(p<0.01);与Model组相比,RA、RAP和Quercetin保护组小鼠的脑系数与肝脏系数均不同程度地增加,且RAP组增加幅度略高于RA组。说明D-半乳糖可使小鼠脑组织发生萎缩,代谢能力下降,加速衰老。经生、炙黄芪提取物或槲皮素保护后可延缓衰老且炙黄芪作用强于生黄芪。(3)生化指标的测定分别测定小鼠肝脏SOD、MDA和GSH指标,结果发现与Con组相比,Model组SOD活力和GSH含量显著下降(p<0.01,p<0.001),MD A含量显著增加(p<0.01);与Mo del组相比,R A、R AP和Q uerc etin保护组SOD活力和GSH含量显著上升,MDA含量显著减少。说明D-半乳糖会促使小鼠机体发生自由基堆积,抗氧化酶活力下降,从而加速衰老。而生、炙黄芪提取物和槲皮素能改善衰老小鼠清除自由基能力,延缓衰老。(4)组织形态学观察采用H&E染色方法对不同组小鼠大脑进行染色,用于观察组织病理学变化。结果表明Con组小鼠神经细胞排列紧密整齐,核大且核仁清晰。与Con相比,Model组小鼠大脑部分神经细胞出现明显的液泡变化,轻度水肿和轻度炎性浸润。相比之下,RA、RAP和Quercetin治疗组的病理异常得到缓解,且RAP的作用最明显,基本接近正常。(5)代谢组学分析采用UPLC-Q-TOF/MS对小鼠血清样品进行分析,结果表明Con组、Model组、RA、RAP和Quercetin保护组各自的组内聚集度好,组间分离度大,且伴有代谢标记物的生成。通路结果显示,与RA抗衰老作用相关的前5个代谢途径为甘油磷脂代谢,色氨酸代谢,亚油酸代谢,α-亚麻酸代谢和鞘脂代谢。与RAP的抗衰老作用有关的前5个代谢途径为甘油磷脂代谢,花生四烯酸代谢,鞘脂代谢,亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢。由此看出,RA与RAP发挥抗衰老作用的代谢途径存在差异。(6)Western blot 分析从网络药理学预测结果黄芪发挥抗衰老主要作用通路中选取PI3K/Akt通路作为研究对象,使用抗PI3K抗体和抗Akt1抗体对不同组肝脏组织进行蛋白质印迹。结果表明,与Con组相比,Mode1组中P13K蛋白表达极显著降低(p<0.01),Akt1蛋白表达显著降低(p<0.05);与 Mode1 组相比,RA、RAP 和 Quercetin 组中 PI3K 和Akt1蛋白表达均升高(p<0.05),且RAP组升高幅度略大于RA组。说明Mode1组小鼠的PI3K/Akt1通路受到抑制,黄芪提取物和槲皮素可以激活PI3K,促进Akt1表达,抑制细胞凋亡,从而延缓衰老。(7)RT-PCR 分析由RT-PCR结果可知,与Con组相比,Mode1组PI3K的基因表达显著下调(p<0.05);与Mode1组相比,RA、RAP和Quercetin组PI3K的基因表达显著上调(p<0.05)。然而,无论是模型组还是保护组,Akt1的基因表达均无明显变化。这说明D-半乳糖可下调PI3K的基因表达,给予生黄芪、炙黄芪和槲皮素治疗后可上调PI3K的基因表达。而D-半乳糖、生黄芪、炙黄芪和槲皮素对Akt1的基因表达均无影响。本课题通过网络药理学和液质联用技术对生黄芪和炙黄芪抗衰老作用机制进行了研究。结果表明,生/炙黄芪可清除衰老小鼠体内的ROS,提高肝脏中SOD活力和GSH含量,降低MDA含量,从而抑制氧化应激,起到抗衰老作用。且生/炙黄芪提取物可促进PI3K基因的表达,致使PI3K蛋白表达增多,并诱导Akt1蛋白的磷酸化,抑制氧化应激,发挥抗衰老作用。不同的是,生/炙黄芪提取物在体内能量代谢途径中存在差异,生黄芪通过抑制血液中TDO活性,从而减少Trp的消耗,促使Trp含量升高,延缓衰老;炙黄芪通过抑制血液中cPLA2活性,减少AA的释放,致使其含量降低,起到抗衰老作用。