空气污染一直是威胁人类健康的重要因素。上世纪早期,随着工业革命的推进,欧美等发达国家先后经历了马斯河谷事件（1930年）、洛杉矶光化学烟雾事件（1943年）以及伦敦烟雾事件（1952年）等一系列空气污染事件,造成了少则几十人,多则上千人的死亡。进入新世纪后,我国经济快速发展,多次发生严重的空气污染事件。例如,2013年冬季发生在我国的大范围雾霾,波及全国100多个大中型城市,污染严重程度创52年来之最。值得注意的是,二氧化氮（NO₂）作为主要的交通源污染物也是造成雾霾发生的重要因素。肺脏是NO₂的首要靶器官,大量研究表明NO₂与哮喘等呼吸系统疾病相关。此外,成年疾病胎源学说（FOAD）认为,胎儿在子宫内生长发育受损,可能会引起成年疾病易感性的增加。一些空气污染物能够穿过胎盘屏障进入子宫内,或者通过对母体造成毒性效应,影响宫内环境进而导致胎儿发育不良,因此胎儿时期污染物暴露可能是子代成年后肺部疾病诱发的重要因素。然而,目前对NO₂的肺部毒性特征和健康效应的研究主要集中在儿童或成年本体,忽略了母体尤其是孕期暴露对子代气道过敏原易感性以及哮喘易感性的影响。为此,本研究基于肺部疾病模型,以NO₂诱导肺部损伤为核心,按照“母体-子代”的经线和“遗传-表观遗传机制”的纬线,深入探讨本体/孕期NO₂暴露引起机体/子代肺部损伤的毒性效应和分子机制。1.NO₂本体暴露会降低机体的肺功能,但其具体的分子机制有待研究。在本体NO₂暴露研究中,我们对Wistar大鼠进行急性NO₂吸入暴露（2.5 ppm,5 h/d,7 d）。NO₂暴露结束后,检测NO₂吸入暴露后大鼠的气道炎性反应及其分子机制。采用苏木精-伊红（htoxylin eosin,H&E）染色观察肺组织病理学改变,利用透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）观察肺组织超微结构变化。在此基础上,利用实时定量RT-PCR技术检测肺组织中促炎因子白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、IL-6和细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）,酪氨酸激酶（janus kinases,JAKs）-信号传递与转录活化因子6（signal transducer and activator of transcription 6,STAT6）信号通路关键因子JAK1、JAK3和STAT6 mRNA表达水平的变化。结果表明,NO₂吸入暴露可以引起肺组织病理学和超微结构改变,增加肺部炎性细胞浸润。此外,我们的研究还发现NO₂暴露能够显著改变IL-6和ICAM-1的表达,分别为对照的1.36和2.01倍。同时,NO₂吸入暴露还会促进JAK3和STAT6的表达,为对照的2.19和1.30倍,提示JAK-STAT6信号通路可能参与了NO₂引起的肺部炎性反应。这一研究为探讨NO₂暴露与肺部损伤的相关性提供了实验证据。2.关于NO₂暴露与肺部损伤的研究主要集中在本体暴露,而有关孕期NO₂暴露与子代肺部损伤的研究停留在相关性方面,其具体的分子机制还不清楚。在孕期NO₂暴露的研究中,我们对妊娠期BALB/c小鼠进行NO₂暴露（2.5 ppm,5 h/d）,持续整个妊娠期。在子代小鼠出生后（PND）1、7、14、21和42天收集子鼠肺组织。采用H&E和马松三色（Masson’s trichrome）染色观察不同发育时期子代小鼠气道炎性和纤维化。在此基础上,利用血细胞计数法和流式细胞术（FACS）分别统计总细胞数和肺部炎性细胞（巨噬细胞（macrophages,Mac）、嗜酸性粒细胞（eosinophil,Eos）、中性粒细胞（neutrophils,Neu）和淋巴细胞（lymphocytes,Lym））数目的变化。同时,采用酶联免疫技术（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测II型细胞因子IL-4和IL-13,I型细胞因子干扰素-γ（interferon-gamma,IFN-γ）。最后,通过亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）考察子鼠肺组织IL4和IL13启动子区甲基化水平。我们的研究结果发现,在PND1,孕期NO₂暴露能够引起子代小鼠哮喘相关的症状,包括:气道炎性浸润,胶原沉积,同时引起肺组织中总细胞数、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞显著增加,刺激IL-4和IL-13的表达,抑制IFN-γ的表达,且这些结果不存在雌雄差异。此外,IL4和IL13启动子区甲基化水平显著下降（分别下降20%和10%）可能分别参与调控IL-4和IL-13水平的表达。更重要的是,这些改变均会随着子鼠的发育而逐渐恢复到正常水平。这一研究结果为孕期暴露诱导子代肺部损伤以及后期子代肺损伤的恢复过程提供了实验证据。3.以上研究发现孕期NO₂暴露能引起新生子鼠呼吸道炎性,但在没有过敏原刺激的情况下,这些反应会随着出生后的生长发育过程逐渐恢复。这一结果提示子代毒性就此终止,还是即使恢复也会造成生命进程中相关疾病易感性变化?又是什么机制参与了子代损伤效应?在本部分实验中,我们对妊娠期BALB/c小鼠进行NO₂暴露（2.5 ppm,5 h/d）,在子代小鼠成年（7w龄）后对其进行OVA雾化暴露2周（30min/d）。暴露结束后,采用Anires2005系统检测子鼠的气道高反应性（airway hyperresponsiveness,AHR:肺呼气阻力（Resistance of expiration,R_e）,肺吸气阻力（Resistance of lung,R_L）,肺顺应性（Respiratory dynamic compliance,Cdyn））,同时利用ELISA检测子鼠血清中OVA特异性IgE（OVA-IgE）并通过H&E染色观察肺组织病理学改变。在此基础上,利用ELISA检测肺组织中肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和IL-1β等促炎因子,关键细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-13和IL-17的表达。关于其信号通路,采用免疫印迹（Western blot,WB）检测技术检测肺组织Th1细胞关键转录因子T-bet、Th2细胞关键转录因子GATA3、JAK1、STAT6以及p-STAT6的表达。综合考察孕期NO₂暴露对子代小鼠对过敏原易感性的影响。结果表明,孕期NO₂暴露能够加重过敏原引起的子代小鼠血清中OVA-IgE以及气道高反应和组织病理学改变。同时,孕期NO₂暴露还可以加重过敏原引起的促炎因子TNF-α和IL-1β的表达以及Th2/Th1细胞分化失衡。此外,JAK-STAT信号通路在此过程中也被激活。这些研究结果提示在子代小鼠肺损伤恢复到正常水平后给予过敏原刺激,孕期NO₂暴露仍能够加重子代小鼠气道对过敏原的易感性。4.流行病学研究发现孕期NO₂暴露会增加儿童过敏性哮喘的发病率和死亡率。在本部分实验中,我们对妊娠期BALB/c小鼠进行NO₂暴露（2.5 ppm,5 h/d）,暴露持续整个孕期。在子代小鼠7w龄和8w龄时进行OVA致敏,9w龄时进行OVA雾化建立子代小鼠哮喘模型。NO₂孕期暴露以及子鼠哮喘建模完成后,采用ELISA检测子鼠血清中总IgE和OVA-IgE含量,通过Anires2005系统检测子鼠的AHR（肺呼气阻力R_e,肺吸气阻力R_L,肺顺应性Cdyn）。利用H&E、Masson和AB/PAS染色观察肺组织病理学改变。结果显示孕期NO₂暴露能够加重哮喘模型子鼠一系列哮喘症状,包括OVA-IgE表达水平、气道高反应性、气道炎性浸润、肺组织纤维化以及黏液细胞增生。在此基础上,利用血细胞计数法和FACS技术分别定量分析总细胞数和肺部炎性细胞（Mac、Eos、Neu和Th2）的变化,发现哮喘建模能够增加总细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞以及Th2细胞的数量,而孕期NO₂暴露可以加剧这一现象。为了研究以上现象中的具体分子靶标,我们利用ELISA检测了哮喘关键细胞因子IL-4、IL-13和IFN-γ的表达,结果表明哮喘建模能够促进IL-4和IL-13的表达,抑制IFN-γ的表达,同时孕期NO₂暴露能够加重这一趋势。在研究其具体表观遗传机制方面,通过BSP技术考察哮喘建模后子鼠肺组织中IL4和IL13启动子区甲基化水平,发现IL4启动子区的去甲基化（与AOO相比下降了9%）参与了该过程。以上研究结果提示孕期NO₂暴露加重了子代过敏性哮喘症状,而这些症状发生与Th2免疫反应和IL4基因启动子区去甲基化相关。本研究为明确孕期NO₂暴露诱导子代毒性效应、揭示生命早期肺损伤和生命进程中遇不良环境刺激相关疾病易感变化提供了实验证据。本研究首先讨论了本体急性NO₂暴露对大鼠肺部炎性和肺组织病理学的影响;在此基础上,研究了孕期NO₂暴露对子代小鼠肺部损伤的影响,发现这种改变可以随着子代小鼠生长发育的逐渐恢复;在子鼠恢复到正常水平后,一方面给予过敏原刺激探讨孕期NO₂暴露增加子代小鼠对过敏原易感性以及其分子机制,另一方面建立哮喘模型,基于DNA甲基化深入探讨孕期NO₂暴露增加子代小鼠哮喘易感性的表观遗传机制。本研究以本体/孕期NO₂暴露为主线,揭示了本体、子代生命早期损伤和生命进程中疾病风险的毒理学过程,为健康风险管理开辟了新思路。