研究背景:皮肤是人体最大的器官,也是机体的一道天然保护屏障。皮肤长期暴露于外界环境,是紫外线照射后最易受损的器官。日光中的中波紫外线(UVB)和长波紫外线(UVA)辐射可引起皮肤的急性损伤(如日晒伤)和慢性累积性损伤(如皮肤光老化、皮肤癌),对人类健康构成潜在危害。UVB部分可达真皮浅层,UVA主要作用于真皮,其深度可达真皮中部,成纤维细胞是其作用的主要靶位。紫外线引起的皮肤过早衰老严重影响人类皮肤健康,探索如何延缓皮肤衰老也一直是国内外学者研究的热点。皮肤老化是一个复杂的生物学现象,包括两方面因素:一是内源性自然老化(主要为遗传因素引起);另一个是受环境因素影响(紫外线、烟尘、气候等)的外源性老化,其中紫外线(UV)的影响尤为主要,被更普遍地定义为光老化。光老化(photoaging)指皮肤衰老过程中紫外线损害的积累,是自然老化和紫外线辐射共同作用的结果。皮肤光老化在组织学上主要表现为胶原成分减少和弹性纤维变性沉积等皮肤基质构成的改变,从而产生皱纹和皮肤弹性减小的临床表现。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞中蛋白质翻译合成的场所,细胞在一些理化刺激或炎性状态下出现新生蛋白质未折叠或错误折叠现象,这些无功能蛋白质堆积,使内质网内环境失调,导致内质网功能紊乱,造成细胞凋亡,称之为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1(HmgCoAreductase degradation 1,Hrd1)是内质网应激过程中E3连接酶的重要一员,它能通过内质网相关降解(ER Associated Degradation,ERAD)途径分解内质网内聚积的错误折叠或未折叠蛋白,保护细胞免于内质网应激,从而减少细胞凋亡,Hrd1作为ERAD途径中重要的连接酶E3的核心部分,它的表达变化将影响E3连接酶对错误蛋白的识别和逆转运能力。而紫外线辐射对皮肤细胞Hrd1表达的影响目前尚无文献报道。探索一种高效且安全性好,能够保护人体皮肤拮抗紫外线损伤的天然产品对人类皮肤健康具有重要意义。传统中药对皮肤的光保护作用已逐渐为人所知。黄芪甲苷(又名黄芪甲甙,Astragaloside,AST)为黄芪皂甙类单体成分,是从黄芪中分离而得到的一种皂甙类植物单体成分,是黄芪的主要有效成分,具有抗氧化损伤、清除自由基、抗炎、抗病毒、抗衰老、调节免疫功能等多方面的作用。数十年来,对黄芪甲苷的药代动力学、药理作用和机制的研究取得了很大进展,已被有效应用于心、脑、肝、血管疾病等许多疾病的治疗。大量研究表明,AST具有清除体内活性氧簇(ROS)和抗氧化应激的作用。近年来,一些研究还发现AST具有抗皮肤老化和抗紫外线的作用。但黄芪甲苷对皮肤成纤维细胞中E3连接酶Hrd1的影响亦尚无报道。因此,本实验以原代培养的人皮肤成纤维细胞为模型,在细胞水平探讨紫外线对人皮肤成纤维细胞E3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干预作用。目的:通过UVA、UVB辐射联合黄芪甲苷处理人皮肤成纤维细胞,观察紫外线对人皮肤成纤维细胞中E3连接酶Hrd1表达的影响以及黄芪甲苷干预后Hrd1的表达变化。探讨E3连接酶Hrd1是否在紫外线所致皮肤光老化中起作用,以及黄芪甲苷是否通过调节Hrd1的表达起到抗光老化作用。方法:1.细胞培养:分离青年包皮环切术后皮肤成纤维细胞(FB),由江苏省人民医院泌尿外科提供。在37℃、5%CO2条件下培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,根据实验目的分别接种在24孔、96孔板及直径10cm的培养皿中。选用4～8代处于对数生长期的细胞进行实验。2.紫外线照射:根据实验设计定时定量进行紫外线照射,选择总剂量为10 J/cm2 UVA或30mJ/cm2 UVB照射处理后,选择合适浓度的黄芪甲苷加入培养基至相应时间点。3.实验分组:A组(正常对照组);B组(单纯低剂量AST干预组);C组(单纯高剂量AST干预组);D组(UVA照射组);E组(UVA照射+低剂量AST组);F组(UVA照射+高剂量AST组);G组(UVB照射组);H组(UVB照射+低剂量AST组);Ⅰ组(UVB照射+高剂量AST组)。4.倒置显微镜:观察成纤维细胞形态的变化。5.MTT法:检测AST对人皮肤成纤维细胞增殖活性的影响,选取无药物毒性的AST溶液最佳低、高浓度。6.RealTime-PCR法:检测各组别成纤维细胞中Hrd1的mRNA表达。7.细胞免疫组化法:检测各组别成纤维细胞中Hrd1的蛋白表达。观察染色结果,并对图像进行半定量分析,比较每组图片平均光密度值。结果:1.不同浓度AST对FB增殖活性的影响在适宜浓度下,黄芪甲苷对体外培养的成纤维细胞有显著的促增殖作用,并呈剂量依赖性,药物浓度为10,20,30mg/L时促增殖作用明显(P<0.001),故确定10、30mg/L为最终实验所需低、高药物浓度。2.紫外线对FB Hrd1 mRNA表达的影响与正常对照组相比,UVA、UVB照射组成纤维细胞的Hrd1 mRNA表达量明显增高,提示紫外线照射(UVA或UVB)可上调人皮肤成纤维细胞中Hrd1mRNA 的表达(P<0.001)。3.AST干预对FB Hrd1mRNA表达的影响与正常对照组相比,单纯高剂量AST干预组中成纤维细胞Hrd1mRNA的表达明显下降(P<0.05),而单纯低剂量AST干预组中成纤维细胞Hrd1mRNA的差异则没有统计学意义(P>0.05);与单纯UVA或UVB照射组相比,紫外线照射后(UVA或UVB)AST干预组(低剂量或高剂量组)成纤维细胞的Hrd1mRNA表达量明显下降,提示黄芪甲苷可显著抑制UV辐射后成纤维细胞中Hrd1 mRNA的表达(P<0.001)。4.紫外线对FB Hrd1蛋白表达的影响Hrd1定位于胞浆,所有组别中的成纤维细胞均有不同强度的Hrd1表达。与正常对照组相比,UVA或UVB照射组中,成纤维细胞形态肥大且不规则,胞浆丰富,Hrd1染色变深,阳性表达率明显,呈强阳性。提示紫外线照射(UVA或UVB)可增加Hrd1的蛋白表达(P<0.05)。5.AST干预对FB Hrd1蛋白表达的影响与正常对照组相比,单纯AST干预组(低剂量或高剂量组)成纤维细胞中Hrd1蛋白表达的差异没有统计学意义(P>0.05);与单纯UVA或UVB照射组相比,紫外线照射后(UVA或UVB)AST干预组(低剂量或高剂量)成纤维细胞的Hrd1蛋白表达量明显下降,提示黄芪甲苷可显著抑制紫外线照射后成纤维细胞中Hrd1的蛋白表达(P<0.05)。结论:紫外线辐射可以上调人皮肤成纤维细胞中E3连接酶Hrd1的表达,而黄芪甲苷对这一现象具有逆转作用。