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研究目的:放射治疗是食管癌(Esophageal cancer)的主要治疗手段之一,但仍有部分患者存在放疗抵抗现象,影响治疗效果;核因子E2相关因子(The nuclear factor E2-related factor,Nrf2)是细胞内重要的抗氧化蛋白,多项研究表明Nrf2对电离辐射后细胞有保护作用,Nrf2过度激活能够提高细胞的抗氧化能力,降低细胞的放疗敏感性;泛素特异性蛋白酶53(Ubiquitin-Specific Protease 53,USP53)是去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes,DUBs)家族中的一员,能逆转底物蛋白的降解,调控底物蛋白的表达;本实验主要研究USP53对细胞内Nrf2的表达的调控,观察USP53的表达情况对食管癌Eca109细胞放疗敏感性的影响。研究方法:1.分别用2Gy、4Gy、8Gy、12Gy、20Gy射线剂量照射食管癌Eca109细胞,置于细胞培养箱中继续培养24h,CCK8实验检测细胞的存活率,Real-Time PCR检测Nrf2的mRNA表达量,筛选出合适的照射剂量,然后通过Western Blot检测经过射线照射后细胞内Nrf2及USP53的蛋白表达情况。2.从购买的含有USP53全长基因序列的质粒中克隆出USP53全长基因片段,然后与酶切好的慢病毒载体质粒重组连接,构建好的USP53重组质粒与病毒包装质粒共同感染293T细胞,收集的病毒颗粒感染食管癌细胞后获得USP53稳定高表达的食管癌Eca109细胞株。3.Western Blot及Real-Time PCR验证USP53稳定过表达食管癌Eca109细胞株的成功构建。4.Western Blot检测过表达USP53的食管癌Eca109细胞内Nrf2的蛋白达情况,提取过表达USP53细胞内的mRNA,检测Nrf2的mRNA表达量是否发生改变,同时检测过表达USP53的细胞株内Nrf2下游的抗氧化应激基因HO-1,NQO-1的mRNA表达情况。5.用Lipo3000转染方法向细胞内转染USP53-siRNA,干扰食管癌细胞内USP53的表达,Real-Time PCR检测USP53的干扰效率,Western Blot检测干扰后USP53及Nrf2的蛋白表达,同样Real-Time PCR检测Nrf2信号通路下游抗氧化应激基因HO-1,NQO-1的mRNA表达情况。6.克隆形成实验检测细胞内USP53过表达及干扰后射线照射对克隆形成率的改变。研究结果:1.射线照射剂量为0-4Gy时,食管癌Eca109细胞内Nrf2的mRNA表达量随着照射剂量的增加逐渐增多,当剂量增加达到8Gy后,Nrf2的mRNA表达量开始减低,CCK8的实验检测到射线剂量达到8Gy的时候细胞的存活率明显降低(SF<50%),因此后续实验选择用4Gy的射线剂量照射细胞。2.Western Blot结果显示4Gy的射线照射细胞后,细胞内的抗氧化蛋白Nrf2及USP53蛋白表达量均增加。3.构建Lenti-CMV-USP53-Puro重组表达质粒,成功筛选出USP53稳定高表达Eca109细胞株。4.Western Blot及荧光定量PCR实验结果显示USP53过表达的食管癌Eca109细胞株成功构建,由于USP53的去泛素化作用,过表达USP53时细胞内Nrf2的蛋白表达量增加(P<0.05),但Nrf2的mRNA表达量不变(P>0.05),Nrf2下游抗氧化基因HO-1及NQO-1的mRNA表达量增加(P<0.05)。5.食管癌细胞内USP53被干扰后,细胞内Nrf2的蛋白表达量减低(P<0.05),但Nrf2的mRNA表达量不发生改变(P>0.05),Real-Time PCR检测到其下游相关抗氧化应激基因HO-1及NQO-1的mRNA表达水平降低,证实了USP53会影响细胞内Nrf2的表达水平。6.克隆形成实验检测显示细胞内USP53高表达的细胞株在射线照射下克隆形成数目高于正常细胞株(P<0.05),而细胞内USP53低表达的细胞株在射线照射下克隆形成数目会降低(P<0.05)。研究结论:1.射线照射后细胞内Nrf2的增加除了电离辐射作用还有USP53表达量增加原因;2.细胞内USP53的水平会影响细胞内Nrf2蛋白的表达;3.USP53导致的Nrf2蛋白表达量的增加能够激活并影响下游抗氧化应激基因HO-1、NQO-1的表达;4.USP53过表达可以增强食管癌Eca109细胞内Nrf2的表达量,导致食管癌Eca109细胞对放疗抵抗,下调USP53可以作为增强食管癌放疗敏感性的潜在指标。