研究目的近年来,糖尿病发病率急剧升高。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见最严重的慢性并发症之一,但其发生的确切机制未明。已有研究表明,炎症反应在糖尿病肾病发生发展中起重要作用。由免疫球蛋白超家族成员如血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein, MCP-1)介导的单核细胞粘附至内皮细胞表面是这一炎症反应的起始步骤,参与介导糖尿病肾病的发生；另外一种重要的致炎性细胞因子血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在糖尿病大鼠肾脏中也呈现高表达,并与微量蛋白尿的病理机制密切相关。上述致炎因子的表达均受到转录因子如核因子-κB (nuclear factor-KB, NF-κB)、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)等的调控。因此,抑制这些致炎因子,或其相关信号通路,可做为预防或延缓糖尿病肾病的重要策略之一。西洛他唑(cilostazol)是一种磷酸二酯酶Ⅲ抑制剂,具有显著的扩张血管和抑制血小板聚集作用,广泛用于治疗代谢综合征等引起的外周血管性疾病及间歇性跛行。近来有大量研究观察到西洛他唑强大的抗炎作用,这可能是西洛他唑治疗糖尿病部分并发症的重要机制。但关于西洛他唑对糖尿病肾病的研究非常少,更难以见到关于西洛他唑对糖尿病时肾脏炎症影响的报道。本研究在前期工作基础上,采用空腹腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,观察糖尿病大鼠肾脏病变,如肾脏肥大指数、尿微量蛋白、肾小球体积,并从分子、基因水平检测肾脏组织VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、VEGF表达,转录因子NF-κB、PPARα、PPARy表达和活性,及cAMP含量,同时观察应用西洛他唑治疗后上述指标的改变,以进一步探讨西洛他唑对DN的保护作用及可能机制。从而为糖尿病肾病的发生机制和临床治疗提供实验性理论依据,也为西洛他唑新适应症的开发提供理论基础。研究方法健康雄性SD大鼠,以65 mg.kg-1链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)腹腔注射诱发糖尿病。随机将已制备成糖尿病模型的大鼠分为3组：糖尿病对照组(DM)15只,高剂量西洛他唑治疗组(西洛他唑27 mg.kg-1.d-1灌胃给药)13只；低剂量西洛他唑组(西洛他唑9 mg.kg-1.d-1灌胃给药)13只。另设正常对照组共10只大鼠。连续治疗8周后处死动物。收集处死前1天24h尿液测尿中微量白蛋白,并计算24h尿蛋白排泄率(urine albumin excretion, UAE)。取肾脏称重,计算肾重／体重。分离肾皮质,用于下列检查：(1)HE染色观察肾脏病理改变；(2) Western blotting检测VCAM-1、ICAM-1蛋白表达；(3) RT-PCR、real-time PCR检测VCAM-1、ICAM-1、PPARα、PPARy基因表达；(4)ELISA检测MCP-1、VEGF、cAMP含量；(5)凝胶电泳迁移率分析(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)检测转录因子NF-κB活性。研究结果1.西洛他唑对糖尿病大鼠体重、血糖和HbAlc水平无显著影响。2.糖尿病大鼠肾重／体重较正常组明显升高(p<0.01),西洛他唑有减轻肾脏肥大的趋势。3.糖尿病组大鼠出现肾小球明显肥大,有轻度炎细胞浸润,肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚,系膜区增宽,细胞外基质增多,近端肾小管上皮细胞肿胀并玻璃样变性；低剂量西洛他唑治疗后上述病理改变得到改善,肾小球系膜区增宽、基底膜增厚均减轻,肾小管变性减少；而高剂量西洛他唑治疗后,几乎恢复至正常状态。糖尿病大鼠肾小球体积比正常大鼠增加2.1倍,高、低剂量西洛他唑可使这种肥大分别减轻51%(p<0.01)和38%(p<0.01),证实了西洛他唑对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。4. Western blotting结果显示,糖尿病组VCAM-1表达较正常组升高近1倍(p<0.01),高、低剂量西洛他唑可使VCAM-1表达分别下降40%(p< 0.01)和28%(p<0.01)。糖尿病大鼠ICAM-1蛋白表达量较正常组升高1倍左右,西洛他唑可剂量性依赖性地降低糖尿病大鼠肾脏ICAM-1蛋白表达。5.既往RT-PCR实验结果显示,DM组VCAM-1、ICAM-1 mRNA表达明显升高；各治疗组较糖尿病组明显降低,以高剂量组降低更明显。Real-time PCR实验进一步验证了上述结果。糖尿病大鼠VCAM-1 mRNA表达是正常组的2倍(p<0.01), ICAM-1 mRNA表达为正常组的1.7倍(p<0.01)；高、低剂量西洛他唑分别引起VCAM-1 mRNA表达下降43%(p<0.01)和40%(p<0.05),使得ICAM-1 mRNA表达下降38%(p<0.01)和25%(p<0.05)。6.糖尿病大鼠肾脏MCP-1含量明显升高,为正常大鼠的2倍(p<0.01),西洛他唑明显降低MCP-1含量,且高剂量降低效果比低剂量更显著；VEGF含量与之类似,糖尿病大鼠为正常大鼠的1.6倍(p<0.01),VEGF水平下降趋势随西洛他唑剂量增加逐渐增高,即高剂量西洛他唑组下降最为明显,低剂量组较弱。7.糖尿病大鼠肾脏组织细胞核内NF-κB-DNA结合活性显著升高,与正常组相比p<0.01；经西洛他唑治疗后NF-κB活性显著下降(在高、低剂量组分别p<0.01、p<0.05)。8. Peason相关性分析显示,VCAM-1 mRNA表达(r=0.967, p=0.000)、ICAM-1 mRNA表达(r=0.880, p=0.000)与NF-κB-DNA结合活性均呈明显正相关。9.糖尿病大鼠肾脏PPARα、PPARy mRNA表达均较正常组明显下降(p<0.01),分别降低31%、34%；西洛他唑则显著增加两种转录因子表达,且均呈现剂量依赖性。10.肾脏中cAMP含量在各组间差异无显著性(p>0.05)。结论我们的研究表明,西洛他唑对糖尿病肾病的保护作用是通过抗炎机制实现的。包括对炎性转录因子NF-κB活性和PPARs表达的抑制,及其下游粘附分子VCAM-1、ICAM-1,趋化因子MCP-1,细胞因子VEGF表达减少。西洛他唑的抗炎作用与cAMP无关。上述结果为应用西洛他唑治疗糖尿病肾病提供了理论依据。研究目的药物基因组学研究认为,药物代谢酶、药物转运蛋白、药物作用受体或靶位等的基因变异是引起药物反应个体差异的根本原因。继药物代谢酶、药物作用靶位多态性研究之后,转运蛋白多态性在药物处置中所起作用的研究正得到越来越多的重视。新型有机阳离子转运体(novel organic cation transporters, OCTN) 2为有机阳离子型药物及内源性物质的新型转运蛋白,在人体组织广泛分布。生理作用为转运肉毒碱参与脂肪酸线粒体β-氧化,对维持心血管、神经及生殖等系统正常功能具有重要的作用。OCTN2还参与多种药物在体内的转运,如p内酰胺类抗生素、维拉帕米、螺内酯、丙戊酸盐、氟喹诺酮类抗菌药等。OCTN2基因变异可改变相应药物体内药动学过程,进而造成药物效应的改变；也可引起OCTN2功能完全丧失,使肉毒碱自尿液排泄增多,引起致死性系统性肉毒碱缺乏；还可导致OCTN2转录和转运功能改变,单独或与其他炎症性肠病相关基因相互作用,增加Crohn’s病、溃疡性结肠炎发生的危险性。迄今为止,已先后完成西方人种及日本人OCTN2基因突变(单核苷酸多态性,single nucleotide polymorphisms, SNPs)测定,且证实某些SNPs与转运功能异常有关。但占世界人口总数1／4的中国汉族人群的相关研究尚未启动。由于几乎所有已知的转运体变异均呈种族依赖性,而难以将从某一种族获得的数据运用于另一种族。目前,检测OCTN2基因变异的主要方法有RFLP、SSCP、DNA直接测序等,这些方法各有其局限性,未在大多数实验室得到应用。变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)技术在筛查单核苷酸多态位点或基因突变方面具有高通量、特异、敏感、高效、廉价等优点,尤为适用于大样本量的未知突变筛查,在人类功能基因SNPs研究中已获得良好的应用。本研究基于OCTN2在介导生理功能和药理效应中的重要作用,旨在查明OCTN2基因多态性在中国汉族健康人群中的分布特征,这将有助于丰富人类OCTN2基因多态性数据库；有助于为药物反应个体差异提供分子水平的解释,促进个体化治疗的实施；也有助于相关疾病发病风险的预测。本研究的另外一个目的是建立DHPLC方法检测OCTN2基因变异的技术平台,结合DNA测序法对中国汉族人群进行OCTN2基因突变分析,从而为临床提供一种快速、高效、自动化的OCTN2基因变异检测方法。研究方法收集92例中国汉族健康成年志愿者,其中男性49名,女性43名,平均年龄23±1.2岁。从外周血中抽提基因组DNA。针对OCTN2基因启动子及1-10号外显子设计引物进行PCR扩增。应用DHPLC技术对扩增产物进行OCTN2基因突变筛查(待测样品与野生型样品以2：1比例混合),通过峰形的差异对样品基因型进行区分,建立检测OCTN2基因的PCR-DHPLC技术平台。根据DHPLC的分析结果,从各种基因型中选取一定数量的样品进行DNA直接测序分析,以确认变异样本的基因型,并验证DHPLC方法的准确性。研究结果1.PCR反应共扩增1012个片段,扩增质量高,且片段大小与预期目的片段一致。2. DHPLC筛查结果显示在扩增片段中出现杂合峰与纯合峰两种情况,单个色谱峰显示为纯合链,双峰则表示是杂合异源双链。共111个扩增产物显示出杂合峰,提示有突变的异源双链存在。3.38例受试者第1外显子发生变异,经DNA测序验证为285T>C(rs2631365),为同义突变,变异发生频率为41.3%。4.40例受试者第4外显子发生变异,经DNA测序验证为1071A>G(rs274558),为同义突变,变异发生频率为43.5%。38例受试者第4外显子／内含子接头处发生变异(T>C),经DNA测序验证为rs274557变异,发生频率为41.3%。16例受试者同时存在上述2种变异,发生频率为17.4%。5.11例受试者第10外显子发生变异,经DNA测序验证为3’端非翻译区碱基缺失(*92delA,rs60522531),发生频率为12%。6.通过一系列DHPLC检测前和检测时各条件的摸索和优化,初步建立了SLC22A5突变筛查的DHPLC检测平台；经DNA直接测序证实,DHPLC筛查基因突变准确率在100%。结论及意义1.本研究系统地对OCTN2基因进行了多态性位点的扫描,这是首次用较大样本量在中国汉族人群中对OCTN2基因遗传多态性进行全面的扫描和分析,查明了中国汉族人群中基因变异情况,及变异发生频率,有助于完善中国汉族人群OCTN2基因多态性数据库,为指导华人个体化治疗并进一步研发相关的检测芯片打下了基础。2.建立了检测OCTN2基因的PCR-DHPLC技术平台,为进一步开展相关检测提供了一种有效可行的方法。采用DHPLC技术筛查点突变其准确性和敏感性都有较大优势,可以极大提高选择性DNA测序的效率。DHPLC对于检测新的点突变是一种很好的方法,作为一种高效、简便、经济可靠的基因突变筛选方法,适合于大规模的基因突变筛查。3.更大样本量的筛查,相应的功能学研究及临床研究正在进行中。