利用噬菌体12肽库筛选猪传染性胸膜肺炎的抗原模拟表位

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猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种高度传染性呼吸道疾病。本研究利用噬菌体随机12肽库对APP菌体及3种主要外毒素(APxⅠ、APxⅡ与APxⅢ)的抗原模拟表位进行了筛选,并对展示在噬菌体表面的模拟表位的免疫原性进行了初步鉴定。主要结果如下: 1.猪传染性胸膜肺炎菌体抗原模拟表位的筛选 利用猪传染性胸膜肺炎疫苗免疫日本大耳兔得到抗血清,将血清用饱和硫酸铵粗提后,再经低压层析系统纯化得到IgG,用此IgG为配体包被酶标板对噬菌体随机12肽库进行3轮不同条件的富集筛选。经过3轮筛选,噬菌体的回收率从5.76×10-5增加到了1.69×10-2,P/N值逐步提高,阳性克隆得到了富集;ELISA表明,随机挑取的10个噬菌体中有6个与纯化的IgG有较强的结合能力,且与无关抗体无交叉反应,特异性良好。梯度ELISA表明,阳性噬菌体克隆与抗血清的结合呈剂量依赖关系。在每一轮的筛选过程中,我们将洗脱下来的噬菌体再用正常的兔血清IgG进行吸附,去除了假阳性的噬菌体克隆,保证了阳性噬菌体克隆的特异性。DNA测序结果显示,所得到的6个噬菌体阳性克隆中,有5个阳性克隆递呈相同的氨基酸序列。 2.猪传染性胸膜肺炎3种主要外毒素抗原模拟表位的筛选与鉴定 将猪传染性胸膜肺炎3种主要外毒素(APxⅠ、APxⅡ与APxⅢ)的抗血清用饱和硫酸铵粗提后,再经低压层析系统得到纯化的IgG,用此IgG作配体包被酶标板对噬菌体随机12肽库分别进行不同条件的富集筛选。经过4轮筛选,噬菌体的回收率与P/N值逐步提高;ELISA表明,随机分别挑取的10个噬菌体中,有5个与纯化的IgG有较强的结合能力,且无交叉反应。在筛选过程中,我们采取外毒素蛋白抗原竞争洗脱的方法,而不是酸洗脱的方法,保证了阳性噬菌体克隆的特异性。DNA测序结果显示,所得到的噬菌体模拟表位与3种主要外毒素蛋白之间有较高的同源性。 3.噬菌体抗原模拟表位的免疫原性研究 利用筛选到的噬菌体阳性克隆、猪传染性胸膜肺炎全菌灭活苗与亚单位苗免疫昆明小鼠,利用间接血凝方法检测菌体抗体并用ELISA的方法检测外毒素抗体,显示有低水平的特异性抗体出现。
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