论文部分内容阅读
目的通过Nrf2-/-小鼠构建胎儿生长受限(Fetal growth restriction,FGR)模型,分析该建模优势,并探讨其诱发肺发育异常的机制研究。方法1.动物模型:7周龄SPF级C57/BJ6 Nrf2野生型(Nrf2+/+)、杂合子(Nrf2+/-)和敲除型(Nrf2-/-)的雌性和雄性小鼠,适应性饲养1周后,将雌鼠按基因型分组为WT、H、KO组,按雌雄1:1合笼配种,配种方式:WT组:♀Nrf2+/+vs.♂Nrf2+/+;H组:♀Nrf2+/-vs.♂Nrf2-/-;KO组:♀Nrf2-/-vs.♂Nrf2+/-。次日上午八点查阴道存在阴道栓和(或)阴道分泌物涂片镜下查见精子,记为孕0.5天(E0.5d),称量孕鼠体重(W0.5d)。孕鼠随机分成烟草暴露组(CSE)和对照组(CON),分别记为:CSE-WT组、CSE-H组、CSE-KO组、CON-WT组、CON-H组和CON-KO组,饲养至E17.5d。E17.5d上午8点,称量孕鼠体重(W17.5d)后处死小鼠,取其心脏血、胎肺、记录胎鼠体重和身长。2.检测孕鼠血清指标:可替宁、MDA、雌二醇、睾酮、血糖、TC、TG、LDL和HDL。3.对胎肺组织进行HE病理染色,分析胎肺组织发育差异。4.对CON-H组和CSE-H组雌性胎鼠肺组织进行转录组测序,分析差异表达基因。5.通过RT-PCR验证测序结果,分析差异表达基因,探讨Nrf2缺失诱发肺发育异常的可能机制。结果1.1 Nrf2基因敲除小鼠胎鼠体重降低:E17.5d,CON-KO组和CON-H组的胎鼠体重明显低于CON-WT组(p<0.05),且CON-KO组的胎鼠体重低于CON-H组(p<0.05);同样,CSE-KO组和CSE-H组的胎鼠体重明显低于CSE-WT组(p<0.01),且CSE-KO组孕鼠的胎鼠体重低于CSE-H组(p<0.05),胎鼠体重的这种差异在CSE暴露情况下,显得更加明显。1.2 Nrf2基因敲除小鼠E17.5d胎鼠FGR的发病率升高:CON-KO组显著高于CON-WT组和CON-H组(p<0.05),CSE-KO组和CSE-H组显著高于CSE-WT组(p<0.05),CSE-H组明显高于CON-H组(p<0.05)。然而,CSE-KO组和CSE-WT组的FGR率虽然分别高于CON-KO组和CON-WT组,但是差异无统计学意义(p>0.05)。1.3 Nrf2基因敲除小鼠妊娠期CSE暴露并未增加不良妊娠结局:死产率:CON-KO组显著高于CON-WT组(p<0.05);CSE-KO组和CSE-H组显著高于CSE-WT组(p<0.05);CON组与CSE组间差异无显著性(p>0.05)。畸形率:各组间差异无显著性(p>0.05)。1.4 Nrf2基因敲除小鼠孕期增重及窝胎数均减少:增重:CON-KO组显著低于CON-WT组(p<0.01),CSE-KO组和CSE-H组显著低于CSE-WT组(p<0.01),余未见显著差异。窝胎数:CON-KO组显著低于CON-WT组(p<0.01),CSE-H组显著低于CSE-WT组(p<0.01),其余组间差异无显著性。1.5 Nrf2基因敲除小鼠妊娠期CSE暴露不影响活仔数:雌雄性别比例无显著差异(p>0.05),但雌性胎鼠体重普遍低于雄性胎鼠,且子代Nrf2-/-型胎鼠体重明显低于Nrf2+/-型胎鼠(p<0.05)。1.6妊娠期烟草暴露影响Nrf2-/-孕鼠血清脂类及激素代谢:可替宁浓度CSE组显著高于CON组,其CSE-H组和CSE-KO组明显高于CSE-WT组;MDA水平CSE组高于CON组,CON-KO组显著高于CON-WT组;血清LDL水平CON-H组显著高于CON-WT组,CSE-H组也高于CSE-WT组;血清HDL水平CSE-KO组低于CSE-WT组,同样CON-KO组低于CON-WT组;血清雌二醇水平CSE-H及CSE-WT组均高于其对照组,CON-KO组高于CON-WT组,睾酮CSE-KO组高于CSE-WT组。血清葡萄糖、TC和TG各组间均无显著性差异。2.1胎肺组织HE染色提示Nrf2-/-雌性胎鼠肺支气管发育异常:CON-H组子代Nrf2-/-雌性(KO1C)支气管出现增生,CSE-H组子代Nrf2-/-雌性(KO1T)支气管出现增生和畸形。2.2胎肺组织转录组测序显示Wnt信号及免疫相关基因表达出现差异:CON-H组与CSE-H组之间Nrf2-/-雌性子代胎鼠胎肺中(KO1C vs.KO1T)共有15个基因差异显著(p<0.05),其中上调基因13个(fold change>2.0),下调基因2个(fold change<0.5)。Metascape聚类分析,差异基因主要与减数重组、Wnt信号和免疫细胞因子相关的分子表达异常。2.3.RT-PCR提示Nrf2-/-小鼠影响肺发育异常:Nrf2缺失后Wnt4表达水平显著升高(H1C vs.KO1C,p<0.001),且母源性烟草暴露的胎鼠中表达水平也明显升高(H1C vs.H1T,p<0.01);Wnt5a在母源性烟草暴露的胎鼠中均表现出表达下调(H1C vs.H1T和KO1C vs.KO1T,p<0.05);且Wnt5b、GSK3β和Fzd在Nrf2缺失胎鼠中均有表达异常(p<0.05)。Nrf2缺失后Ydjc基因表达水平上调(H1C vs.KO1C,p<0.05),在母源性烟草暴露的胎鼠中表达水平升高(H1C vs.H1T,p<0.05),并且母源性烟草暴露Nrf2缺失的胎鼠中表达上调(KO1C vs.KO1T,p<0.05)。Scgb1a1和Foxj-1基因在Nrf2缺失后水平上调(H1C vs.KO1C,p<0.05),在母源性烟草暴露的胎鼠中表达水平显著升高(H1C vs.H1T,p<0.05)。而与免疫相关的Tgtp2和Fgl2基因表达也出现差异。结论1.Nrf2-/-小鼠是一种可行的FGR建模方法,妊娠期CSE暴露增加建模成功率。2.Nrf2对胎鼠体重影响具有性别差异,对雌性胎鼠体重影响大于雄性,且母本Nrf2基因缺失对胎儿体重影响大于父本Nrf2基因缺失。3.Nrf2基因敲除小鼠妊娠期CSE暴露可导致血清LDL、雌二醇和睾酮升高,HDL降低。4.FGR模型中Nrf2-/-雌性胎鼠肺支气管发育异常,可能与Wnt信号通路基因表达异常相关。