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胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是由着床前囊胚的内细胞团在体外培养而获得的,具有自我更新和发育全能性这两大特性,该特性决定了其具有巨大的研究价值和广泛的临床应用前景。近年来,由体细胞重编程为与ESCs特性相似的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)的建立将进一步推动多能干细胞在临床疾病治疗中的应用。
已有的大量研究表明,转录因子Oct4和Sox2对于维持ESCs的特性以及iPS细胞的建立都起着重要的作用,它们蛋白水平的微小改变都可以影响到其下游靶基因的正常表达,进而导致ESCs分化。然而,至今仍不是很清楚Oct4和Sox2蛋白水平以及其下游靶基因在ESCs及其分化过程中是如何被精密调控的。最近的一些研究提示除了Oct4和Sox2之外,还有一些其它的因子参与了它们下游靶基因的表达调控。
在本课题研究中,我们通过亲和层析,以Oct4和Sox2的一个下游靶基因,成纤维生长因子4(fibroblast growth factor4,FGF4),的增强子上包含有Oct4和Sox2结合序列的一段寡核苷酸为饵,发现一个与Oct4和Sox2共同特异性调控FGF4表达的核蛋白一聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP1]。我们的研究发现PARP1以序列特异性依赖的方式,直接与FGF4的增强子结合,并通过对Sox2进行翻译后的多聚ADP-核糖修饰,在ESCs分化过程中正调控FGF4的表达。PARP1可与Sox2直接相互作用,并多聚ADP-核糖修饰Sox2,使得Sox2与FGF4的增强子分离。另外,PARP酶活性可促进Sox2的泛素化修饰和降解。当PARP1缺失或处于低活性时,Sox2的多聚ADP-核糖修饰降低,导致Sox2与FGF4增强子的结合增强;同时,Sox2的泛素修饰和降解都减少,导致Sox2的蛋白水平增加。Sox2的这两种翻译后修饰水平的降低,使得过多的Sox2结合于FGF4的增强子,最终造成FGF4的表达下降。更为重要的是,用小干扰RNAi(smallinterference RNA)干扰的技术特异性地降低Sox2的表达可完全消除PARP酶活性抑制剂对FGF4表达的抑制作用,说明Sox2蛋白水平的升高对PARP酶活性抑制剂抑制FGF4表达是必需的。
另外,我们的研究发现,PARP1缺失并不影响未分化ESCs的生长状态,当在ESCs去饲养层(feeder layer)培养自发分化或去饲养层培养24小时后再加RA诱导分化的过程中,来源于PARP1-/- ESCs的分化细胞的生长或生存能力受到了抑制。这一现象类似于FGF4-/-ESCs的分化细胞。外源的FGF4因子可以部分恢复这些细胞的生长或生存能力。我们也发现,PARP1-/-ESCs在上述培养分化条件下,高表达滋养层巨细胞(trophoblast gant cells)的分子标志基因,如Handl,并且低表达滋养层(trophectoderm)和原始内胚层(primitive endoderm)早期分化的标志基因FgfR2和Hnf4。有趣的是,在FGF4-/-囊胚中,这两个基因的表达也降低。外源的FGF4因子可以降低Hand1的表达,并增加FgfrR2和Hnf4的表达。这些结果提示PARP1和FGF4具有功能相关性,PARPl的功能部分是通过FGF4实现的。
总而言之,本研究的主要结果包括:1)发现一个与Oct4/Sox2相互作用并参与它们对下游靶基因表达调控的新因子;2)Sox2是PARP1的第一个被证明在PAR修饰后经蛋白酶体降解的转录因子;3)发现蛋白翻译后修饰对于Sox2蛋白水平及其功能的重要调控作用;4)确立在ESCs分化过程中PARP酶活性与FGF4表达水平的关系。以上发现对于阐明Oct4/Sox2调控其下游靶基因的表达和维持ESCs自我更新的分子机制有重要意义。同时,这些结果揭示了PARP1通过翻译后修饰Sox2而影响FGF4转录这一新的功能,使我们更容易明白PARP1缺失所导致的细胞表型的分子基础。此外,Sox2作为体细胞重编成的重要因子之一,我们的研究对于提高建立iPS细胞的效率及明确重编程的分子机制有一定的提示作用。