本文首先克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)dmrt1、dmrt4和sox9基因,连同已知的P450arom,研究了这4个基因在成鱼各组织的表达差异谱,明确了它们的两性差异表达模式,进一步定量和定位分析了这些基因在性腺分化和发育过程中的表达;并在体外对dmrt1基因进行了原核重组表达,同时从表观遗传学水平上研究了从头DNA甲基化转移酶基因dnmt3基因的表达差异图式以及性腺中性别相关基因启动子CpG岛的甲基化水平与这些基因两性表达差异的相关性。研究表明:牙鲆dmrt1基因cDNA全长3373bp,其5’UTR中存在与性别相关的转录因子Sry、Sox9和Sox5的结合位点,编码蛋白含有保守的DM结构域;dmrt4基因包含2个外显子和1个内含子,其5’UTR中有性别相关的转录因子Sox9的结合位点,编码产物含有保守的DM结构域和特有的DMA结构域;sox9基因包含3个外显子和2个内含子,在其5’UTR中发现了转录因子Ftz、Foxd3和Oct1的结合位点,编码蛋白含有保守的HMG结构域。牙鲆P450arom基因5’UTR中具有性别相关的转录因子Foxl2和Sf1的结合位点以及DM结构域的结合位点。组织特异表达研究显示,牙鲆dmrt1、dmrt4、sox9和P450arom均为两性差异表达的性别相关基因。dmrt1基因在牙鲆性腺中特异表达,且在精巢中的表达强于卵巢;dmrt4和sox9基因的表达范围相对较广,在性腺、脾脏、鳃、脑和胃等组织中都有不同程度的表达,且也都是在精巢的表达较卵巢的表达强;而P450arom基因在卵巢中的表达明显强于精巢,在其它一些组织中有强弱不同的表达。根据real-time RT-PCR结果可以看出,dmrt1基因在牙鲆原始性腺和性腺分化期间的表达都很低,在分化的精巢中表达强度迅速上升,而在卵巢中的表达却依然很弱。dmrt4则在原始性腺中高表达,其后的性腺分化期间表达降到很低的水平,然后在分化的精巢中强表达。sox9基因在牙鲆原始性腺中高表达,之后在性腺分化期间的表达呈现上下浮动的模式,在分化的精巢卵巢中具有不同程度的表达。P450arom在原始性腺中开始表达,其表达量在性腺分化期间有向上向下浮动的变化趋势,其后在分化的卵巢早期发育阶段表达很强。这4个基因在牙鲆各期性腺中的表达也各有不同,dmrt1在牙鲆I期性腺中表达很弱,II期精巢中表达量迅速上升,到了IV期精巢,其表达量有所下降,V期精巢中的表达量又上升而达到峰值;dmrt1在II期到V期卵巢的表达量却都极低。dmrt4基因在I期和II期精巢中表达很强,且呈上升趋势,其后在III、IV期精巢中的表达急剧下降,到了V期精巢,其表达量又略有回升;而其在各期的卵巢中表达一直很低。sox9在牙鲆I期精巢的表达量较卵巢的低,之后精巢中的表达开始上升,II期到V期精巢中该基因的表达量均较卵巢中的高,II期卵巢达到峰值,III到V期卵巢却几乎不表达。P450arom基因在I到V期卵巢的表达量均高于同期精巢的表达量,其中I期和II期的差异较大,这两个时期卵巢中的表达量很高,其后各期卵巢中的表达有所降低,而精巢中的表达量一直处于较低水平。性腺组织切片原位杂交定位表达分析可知,dmrt1、dmrt4和sox9基因的转录本主要定位于牙鲆精巢的精母细胞和Sertoli细胞,且在精母细胞中的表达强于Sertoli细胞的表达;在卵巢中,这3个基因的杂交信号都很弱。牙鲆P450arom基因则主要在卵巢的滤泡细胞和卵母细胞中表达,且滤泡细胞的表达强于卵母细胞中的表达,在精巢的精母细胞中却弱表达。整体原位杂交定位表达研究结果显示,在牙鲆胚胎发育过程中,dmrt4在外胚层来源的嗅基板,以及神经外胚层来源的前脑、端脑和耳基板中表达。从神经胚期到孵化期的所有时期,dmrt4基因在嗅基板的表达一直很强,而在端脑中的表达则存在动态变化。在胚胎发育的较早阶段,dmrt4的转录本分布于前脑中,并从神经胚期到尾芽形成期保持强表达;在早尾芽期,表达变得相对较弱,并逐渐局限于背侧端脑第一脑室周围的一小片区域。从5-6体节期到孵化期,低水平的转录本还可以在听基板中检测到。甲基化表观遗传修饰水平研究结果显示,牙鲆dmrt1、dmrt4和P450arom基因启动子CpG位点的甲基化水平存在两性差异: dmrt1启动子CpG位点在精巢中的甲基化水平为0,卵巢中的甲基化水平为57.69%,相应的,该基因在精巢的相对表达量约为卵巢的70倍。P450arom基因启动子CpG位点在卵巢的甲基化水平为73.33%,精巢中的甲基化水平为97.5%,该基因在卵巢的相对表达量约为精巢的40倍。dmrt4启动子CpG位点的甲基化水平在精巢中的甲基化水平(2%)较卵巢中的(7%)略低,这也与该基因在精巢中的表达强于卵巢的表达的两性差异表达模式是一致的。但是,sox9基因启动子CpG岛甲基化水平在精巢卵巢中却没有差异,都是完全去甲基化的,这与其在两性性腺中的差异表达图式不存在相关性。牙鲆从头DNA甲基化转移酶基因dnmt3存在两性差异表达,在精巢中的表达强于卵巢中的表达,在肾脏、脾脏、脑和眼睛中也有不同程度的表达。该基因在原始性腺表达较高,在性腺分化期间的表达上下浮动,在分化和发育的精巢卵巢中均具有两性表达差异。应用原核表达系统对Dmrt1蛋白进行体外重组表达:将牙鲆dmrt1基因序列插入到表达质粒pProEXTMHTa上,在大肠杆菌E.coli BL-21中进行体外表达与分析。该重组蛋白分子量约为32.5KDa,存在于宿主菌中,没有分泌到细胞外。诱导的菌体经超声破碎后,在沉淀和上清的样品中都有目的蛋白的条带存在,大部分的Dmrt1重组蛋白以包涵体形式出现在沉淀中,只有少量的蛋白以可溶形式存在于上清中。当诱导时间4 h、IPTG浓度0.6mmol/L时,重组蛋白表达量最大;在诱导温度为34℃时,表达的可溶蛋白的量比例最大。