研究背景多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种免疫介导的中枢神经系统(central nervous system, CNS)炎性脱髓鞘性疾病,临床上大多呈复发-缓解病程,疾病晚期可以导致患者的功能残疾。MS的组织病理学较为复杂,包括不同程度的反应性星形细胞增生、巨噬细胞活化、髓鞘脱失以及轴索损害等。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的,以CNS内小血管周围单个核细胞浸润及髓鞘脱失为主要特征的自身免疫性疾病,是人类MS的理想动物模型,在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。不同的致脑炎抗原、免疫方法及不同的实验动物可制备各种类型的EAE模型,如急性型、缓解复发型和慢性型等。本研究使用含有髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)成分的豚鼠脊髓匀浆诱导雌性Wistar大鼠建立EAE模型,观察其发病过程的临床症状和病理学改变,以适应本实验研究的需要。炎性改变和髓鞘脱失一直是MS病理学研究的主要内容。然而,近年来有大量证据表明,MS疾病后期不可逆的神经功能障碍与日积月累的轴索损害有着密切的联系,这种轴索损害在疾病早期就已存在。有研究表明,轴索损害对MS疾病的临床症状和预后有很大的影响,它和炎性改变、髓鞘脱失一样是MS病理学的重要特征。MS不同阶段轴索损害的机制可能不同,疾病早期神经功能障碍可能是由于炎性脱髓鞘造成的急性轴索损害引起的。炎症条件下,各种炎性因子、一氧化氮、谷氨酸等毒性物质的积累会造成髓鞘和轴索破坏,一旦轴索损害发展到阈值时预编程的进行性神经功能退行性变就会被触发,因此我们应该在MS早期阶段积极抗炎治疗和保护轴索治疗,预防和延缓神经功能残疾的发生。晚期的神经功能障碍则可能与慢性脱髓鞘斑块中缓慢进展的轴索损害有关。轴索损害越重,MS的预后越差。由此可见,轴索损害可以发生在MS早期阶段；轴索损害与患者永久性的神经残疾有关；轴索损害可以在MS缓解后的复发中发挥重要的作用；明确轴索损害的机制可以更好的指导MS的临床治疗策略。MS患者脱髓鞘斑块形成的早期即可出现淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)积聚,而APP积聚被认为是轴索损害的一个特征性标志,表明在患者脱髓鞘的同时轴索也受到损伤。神经丝蛋白是轴索细胞骨架的主要组成成分,其磷酸化反应主要受髓鞘形成、髓鞘脱失和轴索的病理改变等影响。非磷酸化神经丝蛋白(Nonphosphorylated neurofilament, SMI-32)多存在于神经元细胞的胞体和树突中,而有髓鞘包裹的正常轴索骨架中的神经丝蛋白多是磷酸化的,磷酸化的神经丝蛋白不会呈现SMI-32染色阳性,因此当发现大量SMI-32染色阳性纤维时即可说明轴索损害已存在。因此本研究在成功建立Wistar大鼠EAE模型的基础上通过不同的病理染色技术观察EAE的炎症浸润、髓鞘脱失和轴索损害的病理特征,重点探讨MS轴索损害的特点及其发生机制,对深入探讨MS的发病机制、指导临床MS的诊断及治疗具有重要意义。方法1、豚鼠处死后于无菌条件下分离脊髓,加入少量的生理盐水研磨,制备新鲜的脊髓匀浆与等体积完全弗氏佐剂充分混合,配成抗原-佐剂乳化液(GPSCH-CFA)用于制备EAE动物模型。2、EAE模型组大鼠分为三个亚组：EAE免疫后第4天组(EAE4d组)EAE免疫后第14天组(EAE14d组)和EAE免疫后第24天组(EAE24d组),每只EAE模型组大鼠双后足垫皮下注射0.4mlGPSCH-CFA,并于免疫0h和48h内分别腹腔注射百日咳毒素400ng,对照组每只大鼠双后足垫皮下注入相同剂量的免疫佐剂及生理盐水。3、对免疫动物进行持续的行为学观察、临床症状评分,所有实验数据均以均值±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件分析。每组大鼠免疫后在相应时间点取大鼠的脑和脊髓,制成冰冻切片。对大鼠的脑和脊髓进行HE染色、Luxol fast blue (LFB)髓鞘染色和Bielschowsky (?)神经纤维轴突染色,并分别以间接免疫荧光方法双染标记SMI-32和MBP,以及APP和MBP。结果1、行为学改变Wistar大鼠免疫后第8-12天逐渐出现神经症状,起病的首发症状为尾部张力下降,体重减轻,尾部张力消失、拖垂,后肢麻痹无力,可伴有大小便失禁,人为翻身后不能自行恢复体位,严重者四肢麻痹,濒临死亡随着病程的进展,神经功能损伤评分逐渐增高,在免疫后14-16天达到发病高峰,其后随着病程时间延长,上述症状开始好转,一般可恢复到正常状态,仅少数大鼠残留尾部拖垂。表现为一次性急性发病过程,发病率为100%,高峰期平均神经功能评分为3.84分。发病过程中体重普遍下降,在恢复期随着临床症状的缓解,体重也逐渐恢复。对照组大鼠一直无明显变化,体重持续上升,行为未见明显改变。2、病理改变①HE染色：EAE4d组大鼠脑和脊髓中未见明显的淋巴细胞浸润、神经细胞坏死和脱髓鞘、轴索损害改变。EAE14d组大鼠的脑和脊髓实质中均可见弥漫的炎症细胞浸润,特征性的血管“袖套”样改变,神经元的变性、水肿,炎性病灶中胶质细胞不同程度增生；②Luxol fast blue (LFB)髓鞘染色：可见片状髓鞘脱失、部分脱髓鞘病灶内有炎细胞浸润；③Bielschowsky神经纤维轴突染色：散在银染色缺失病灶,呈空泡样改变,轴索断裂、排列紊乱。EAE24d组大鼠炎症细胞浸润较EAE14d组大鼠明显减轻,神经细胞不可逆的变性、坏死,并出现明显胶质增生,可见胶质细胞结节；脱髓鞘病灶中的炎症细胞浸润程度较前减轻,髓鞘破坏后结构松散,或融合呈空泡状；轴索断裂、排列紊乱更为严重,空泡样改变仍较明显。对照组大鼠的脑和脊髓组织未见明显异常。④免疫荧光：双染标记SMI-32和MBP后在共聚焦显微镜下观察可见,EAE4d组大鼠未见明显异常。EAE14d组大鼠脑和脊髓白质中存在大量SMI-32染色阳性的轴索,有部分轴索染色不连续,结构、直径等发生异常,部分SMI-32染色阳性的轴索髓鞘染色并未缺失,提示髓鞘脱失和轴索损害的发生不同步。EAE24d组大鼠可见相似的改变。双染标记APP和MBP后在共聚焦显微镜下观察可见,EAE14d组大鼠脑和脊髓白质中可见APP免疫反应阳性物质堆积形成的轴突卵形体,其周围的轴索未见明显的髓鞘脱失,也说明髓鞘脱失和轴索损害的发生并不是同步进行的。EAE24d组大鼠上述变化仍然存在。结论1、以豚鼠脊髓匀浆为抗原免疫Wistar大鼠可成功诱发EAE,此方法制备EAE模型的发病率高,稳定性好,实验动物较易获得。表现为一次性急性发病过程,整个疾病过程时间较短,方便完整地观察整个发病过程的行为表现,可以作为研究MS较为理想的动物模型。2、发病高峰期开始,EAE大鼠的脑和脊髓实质中可见弥漫的淋巴细胞炎症改变,出现特征性的血管“袖套”样改变。3、发病高峰期开始,EAE大鼠的脑和脊髓实质中出现大片脱髓鞘病灶,部分脱髓鞘病灶内有炎细胞浸润。4、EAE的轴索损害开始于疾病的早期阶段,并不断进展。表现为轴索断裂、排列紊乱、空泡样改变。5、髓鞘脱失和轴索损害的发生并不是同步进行的。