【摘 要】
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目的：构建能够在体外真核细胞中过表达目标基因Brcc3的重组腺病毒真核表达载体,并进而使用HEK293细胞包装重组腺病毒,从而为后续转染小鼠心脏成纤维细胞(cardiofibroblasts, c
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目的：构建能够在体外真核细胞中过表达目标基因Brcc3的重组腺病毒真核表达载体,并进而使用HEK293细胞包装重组腺病毒,从而为后续转染小鼠心脏成纤维细胞(cardiofibroblasts, cFs)探讨细胞内Brcc3基因过表达对TGF-β信号通路各环节的影响做准备。方法：1、目的基因片段的扩增(扩增包括双酶切位点的目标基因序列)分别以Ndel-Sacl-Brcc3-F和Brcc3-R为上下游引物扩增Sacl-Brcc3;以Brcc3-GST-F和Xhol-Spel-GST-R扩增GST-Xhol及以Ndel-Sacl-Brcc3-F和Xhol-Spel-GST-R扩增Sacl-Brcc3-GST-Xhol。2、利用酶切连接构建pDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP并测序鉴定Sacl/Xhol双酶切骨架载体pDown-MCS-IRES/EGFP和PCR回收产物Sacl-Brcc3-GST-Xhol,并将骨架片段pDown-MCS-IRES/EGFP和目的基因Brcc3-GST连接,接着转化连接产物到感受态细胞大肠杆菌stbl3,进行菌落PCR鉴定后挑取单克隆摇菌提取质粒pDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP送测序。3、利用Gateway Technology构建pAV.Ex1d-CMV>Brcc3/GST/IRES/EGFPpDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP和pAV.Des1d进行LR反应,将目标基因克隆到腺病毒载体pAV.Des1d,于(反应产物转化到)大肠杆菌感受态细胞stbl3中进行(复制),PCR鉴定阳性克隆,挑单克隆摇菌提取质粒送检测序。4、将重组腺病毒转染293A细胞,进行病毒的包装和扩增,并提取转染的CFs细胞蛋白行Western blot检测Brcc36蛋白表达水平。主要结果：1、经琼脂糖电泳鉴定表明目的片段Sacl-Brcc3-GST-Xhol扩增成功。2、经PCR检测、琼脂糖电泳及基因测序表明载体pDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP构建成功。3、经PCR检测、琼脂糖电泳、基因测序及western blot分析表明重组腺病毒真核表达载体pAV.Exld-CMV>Brcc3/GST/IRES/EGFP构建成功。主要结论：本研究利用Gateway技术成功构建重组腺病毒真核表达载体pAV.Exld-CMV>Brcc3/GST/IRES/EGFP,并成功包装获得过表达Brcc3基因的腺病毒。
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《国外采矿技术快报》正式创刊了,这是我国有色金属工业战线广大采矿工程技术人员盼望的喜事,我们长沙公司谨致热烈祝贺! 我国是一个有色金属矿产资源丰富,开采历史悠久的国
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