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背景:研究表明,增加成骨前体细胞一骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的含量及强化骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)等细胞因子的调控,对骨再生修复起到关键作用。基因转染能够实现二者的有机结合,然而当前基因转染要应用于临床骨再生修复的基因治疗,仍然面临着安全差、基因转染效率较低且转染过程不可视、可控等问题。目的:将BMSCs与rhBMP-2通过基因转染有机整合,提出一种将生物相容性好、粒径微小且超声成像能力佳的生物合成纳泡(Gas Vesicles,GVs)作为rhBMP-2基因载体,通过细胞内吞手段引入BMSCs内,超声辐照激发细胞内GVs破裂产生细胞内空化效应提高细胞核膜通透性,实现高效、安全、可视的核内基因递送新手段。并从超声成像能力、基因转染表达能力角度,对其实现在体可视化转染rhBMP-2促骨再生修复的潜能进行初步实验探讨,为干细胞示踪及基因转染另辟蹊径,并为临床骨科再生治疗提供新策略。方法:1、对传统方法进行了传代、降低离心能量等改良以高效制备出生物合成纳泡GVs,加入碘化丙啶(PEI)制备阳离子化GVs(GVs-PEI),透射电镜分析形态学表征、动态光散射(DLS)技术测量平均粒径、zeta电位,超声成像仪检测超声成像性能及稳定性。2、共孵育法制备生物合成纳泡-干细胞复合体(GVs@BMSCs),并对GVs-PEI被BMSCs的吞噬量及在细胞中的稳定性进行荧光检测,采用CCK-8法检测制备后24-72h的细胞增殖活性,使用体外琼脂仿体及活体大鼠肌内注射对其超声成像效果进行检测。3、①构建rhBMP-2基因生物合成纳泡-干细胞转染复合体(rhBMP2-GVs@BMSCs)。②采用GVs荧光染色及钙黄绿素/PI染色,分别从GVs入核效率和细胞膜、核膜开孔效应角度,验证超声介导细胞内空化效应的基因递送机制。③通过对比不同声强超声转染的EGFP蛋白表达量及细胞活性,对体外转染的优选超声参数进行摸索。④通过荧光显微镜观察转染后EGFP表达量及ELISA法对细胞培养上清液中rhBMP-2蛋白的含量进行定量分析,检测蛋白表达效率。⑤使用上清液对正常BMSCs进行成骨诱导分化培养,从碱性磷酸酶表达及钙结节生成情况探究其促进BMSCs成骨分化的有效性。结果:1、采用改良方法制备出了浓度更高的GVs。透射电镜显示GVs为形态大小均一的纺锤形气囊结构。经PEI阳离子化后制成GVs-PEI,DLS检测结果显示其平均直径为(383.6±11.55)nm,zeta电位为(18.5±2.20)mV。超声成像检测结果显示GVs-PEI在体外随着浓度的增加,超声造影信号也随之增强,最佳成像浓度为OD500=1.0,且其成像能够持续4天。2、成功构建了 GVs@BMSCs,荧光染色显示:GVs-PEI在BMSCs细胞质中呈现大量红色点状荧光显影,且能稳定存在4天,且当孵育浓度为OD=0.5-1.0时,内吞GVs不影响BMSCs的细胞增殖活性。对GVs@BMSCs进行超声成像,结果显示:在体内外GVs@BMSCs均显示出明显的超声成像增强效果,与单纯BMSCs组相比其信号强度差异具有统计学意义,且成像效果能持续至少6天(P<0.001)。3、①成功构建了rhBMP2-GVs@BMSCs。②荧光染色法对超声内空化基因递送机制进行验证,结果显示:超声激发后BMSCs中GVs红色点状荧光与细胞核蓝色荧光重叠,GVs成功进入细胞核;钙黄绿素/PI染色超声激发后BMSCs,细胞质为绿色荧光且细胞核为红色荧光,细胞核膜通透性提高。③当超声参数为1 W/cm2、1MHz、占空比20%、1min时,EGFP表达量较多且对细胞活性未见明显影响(P>0.05),为激发细胞内空化效应进行转染的优选超声参数。④对基因转染及蛋白表达效率进行检测,显示超声激发rhBMP2-GVs@BMSCs转染组EGFP表达量及荧光强度明显高于其他对照组,且能持续表达14天;ELISA检测显示超声激发rhBMP2-GVs@BMSCs组细胞培养上清中rhBMP-2蛋白浓度最高(P<0.001),高达普通BMSCs组的3.9倍,且能持续分泌21天。⑤使用超声激发rhBMP2-GVs@BMSCs组细胞上清液培养的BMSCs碱性磷酸酶表达量及钙结节生成量均较其他对照组明显增多,有效促进BMSCs成骨分化。结论:GVs-PEI内吞标记实现了超声下安全、稳定且较长时间的BMSCs成像示踪,为干细胞在体示踪提供了新方案。超声介导细胞内空化效应调控rhBMP2-GVs@BMSCs基因转染,能够显著提高细胞核膜通透性,完成rhBMP-2基因安全、高效的核内递送及表达,实现rhBMP-2细胞因子持续、稳定释放,调节成骨内环境,促进BMSCs成骨分化。同时,该体系有望实现在体可视化、可调控的BMSCs基因转染,促进骨再生修复。