银纳米粒子负载异荭草素的制备及肝细胞损伤的作用研究

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金属纳米粒子被广泛用于构建纳米载体,其中银纳米粒子(Silver nanoparticles,AgNPs)因具有较高膜穿透性、低毒性、高生物相容性等优点,被广泛应用于活性成分载体和疾病治疗诊断等领域。已研究表明,金属纳米粒子负载黄酮类化合物可提高后者生物利用率和功能活性。异荭草素(3’,4’,5,7-四羟基黄酮-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,Isoorientin,Iso)是一种存在于食物中的天然黄酮类物质,具有多种功能活性,如抗癌、抗炎、抗氧化、保肝等。黄酮类化合物易受光照等外界因素的影响很难充分发挥其活性功能,且有关金属纳米粒子负载Iso的研究鲜有报道。因此,本论文首先以玉米淀粉为原料采用绿色方法制备AgNPs,并对Iso进行负载制备负载Iso的功能化AgNP(AgNPs-Iso);其次,对AgNPs-Iso进行结构表征、稳定性测试、抗氧化性和抑制肝细胞损伤的作用研究。主要研究结果如下:1.绿色方法制备获得AgNPs,并成功负载Iso。通过紫外光谱分析、红外光谱分析,激光粒度仪和场发射透射电镜进行AgNPs和AgNPs-Iso结构表征,发现添加少量柠檬酸钠可明显提高由玉米淀粉为原料制备的AgNPs的产量,其粒径为65.40±0.87 nm,球形。AgNPs对Iso的负载率为76.60%,粒径为117.20±2.13 nm。2.AgNPs-Iso具有优异的稳定性和抗氧化能力。通过在不同pH值,不同浓度盐溶液以及体外模拟胃肠道消化条件下来评价AgNPs-Iso的稳定性,并且通过DPPH自由基、ABTS+自由基、·OH自由基和O2-·自由基清除实验评价AgNPs-Iso的体外抗氧化活性。试验表明,在pH 5-9和0-0.30 mol/L的NaCL溶液环境中时,AgNPs和AgNPs-Iso均稳定;在体外模拟胃肠道消化过程中,AgNPs-Iso较AgNPs具有更高的稳定性。同时,相比Iso,AgNPs-Iso具有更强的清除DPPH、ABTS+、·OH 和 O2-·自由基的能力。20 μg/mL AgNPs-Iso 清除 DPPH、ABTS+、·OH和O2-·自由基效率较Iso分别高9.24、1.70、30.23和3.14%。3.AgNPs-Iso无细胞毒性且可有效预防食品加工有害产物苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene,BaP)诱导的HL-7702人肝细胞损伤。通过红细胞溶血率和HL-7702人肝细胞活力检测,评价AgNPs-Iso的细胞毒性;同时,建立食品加工有害产物BaP损伤HL-7702人肝细胞模型,通过MTT、台盼蓝染色、荧光标记、流式细胞术、Westernblot(WB)方法检测AgNPs-Iso对BaP诱发的HL-7702人肝细胞凋亡、自噬和焦亡性损伤的影响。红细胞溶血和HL-7702人肝细胞活力试验初步确定了 AgNPs-Iso无细胞毒性。MTT和台盼蓝染色试验结果显示Iso和AgNPs-Iso均可显著提高BaP损伤的HL-7702肝细胞活力,抑制肝细胞形态受损。细胞周期试验显示Iso和AgNPs-Iso预处理,可有效抑制细胞停滞于S期。此外,AO-EB染色、细胞凋亡率、ROS检测及JC-1荧光标记结果显示,Iso和AgNPs-Iso可通过减少肝细胞凋亡数量和ROS产生量,提高细胞线粒体膜电势抑制BaP诱导的HL-7702人肝细胞凋亡性损伤;AO、MDC染色以及WB试验表明:Iso和AgNPs-Iso可通过减少肝细胞自噬泡数量,下调自噬特征蛋白LC3和Beclin-1蛋白表达抑制BaP诱导的HL-7702人肝细胞自噬性损伤;膜孔观察、相对电导率、LDH以及WB试验显示:Iso和AgNPs-Iso通过减少细胞相对电导率、LDH释放量和细胞膜孔数量,下调焦亡特征蛋白Caspase-1和GSDMD蛋白表达含量,减缓BaP诱导的肝细胞焦亡性损伤。AgNPs-Iso较Iso具有更强的抑制肝细胞损伤作用。本论文较为系统评价AgNPs负载Iso对Iso结构和生物活性,为促进和拓展Iso开发利用提供了一定的理论依据和技术参考。
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