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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素，与胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的发病密切相关，WHO已将其列为第一类致癌因子。一般认为，H. pylori是一种胞外致病菌，但越来越多的证据显示该菌能在胃上皮细胞中生存增殖，抗生素和机体免疫反应均不能清除胞内的H. pylori而导致持续性感染引起胃部疾病的发生。深入阐明H. pylori慢性感染机制对揭示其致病机理、发展新的有效的H. pylori感染治疗手段具有重要的理论指导意义。自噬(Autophagy)是一种机体生存、分化、发育、代谢必需的溶酶体降解途径，其主要的功能是保护机体免受各种致病因素的侵袭，并在抗病原微生物感染及其导致的炎症中发挥重要作用。H. pylori感染可诱导胃上皮细胞产生自噬，而自噬抑制促进H.pylori的胞内存活。microRNA (miRNA)是一类长度约19-24个核苷酸的内源性非编码RNA分子，主要存在于真核生物中，主要通过与靶mRNA3′端非翻译区互补结合，诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译，从而实现转录后基因调控作用。课题组前期研究发现，H. pylori感染能够引起胃上皮细胞miRNA表达谱发生变化：MIR155、MIR16、 MIR146A、MIR30B、MIR222等表达出现升高，MIR90B等则表达下调(J Infect Dis2009,16-25)，且MIR155和MIR146A有负性调控胃上皮细胞表达促炎症因子的作用。同时，MIR30B不仅在体外感染模型中表达升高，而且在临床活检标本中也观察到MIR30B表达量在H.pylori感染组胃粘膜组织显著高于未感染组。另外，在H. pylori感染诱导胃上皮细胞自噬模型中，我们通过免疫印迹和激光共聚焦显微镜技术发现，MIR30B能明显抑制自噬信号蛋白LC3的Ⅰ型向Ⅱ型转变，以及抑制GFP-LC3的荧光蛋白聚集，提示MIR30B参与了H. pylori引起的自噬调控。那么MIR30B是通过什么机制来抑制自噬的形成呢？目前尚不清楚。BECN1和ATG12作为自噬信号通路上的两个重要分子，在自噬发生过程中发挥关键作用。生物信息学分析显示：它们可能是MIR30B的靶标蛋白。为此，我们提出MIR30B调节幽门螺杆菌诱导的胃上皮细胞自噬与持续性感染的如下机制设想：MIR30B通过调节自噬通路中的信号蛋白BECN1和ATG12而发挥抑制作用，从而影响到H. pylori被清除，导致H. pylori在自噬体中生存繁殖而发生持续感染，引起慢性胃炎、消化性溃疡，甚至胃癌等疾病。本研究通过H. pylori感染人胃上皮细胞自噬模型和临床胃粘膜标本的检测，以MIR30B为研究对象，采用实时定量PCR技术对其表达进行鉴定；分别转染MIR30B模拟物及抑制剂上调和下调胞内MIR30B的水平，采用Western-blot、激光共聚焦、电镜等技术观察MIR30B在H. pylori感染中的自噬变化；结合生物信息学和萤光素酶实验等鉴定MIR30B的靶基因--BECN1和ATG12；并进一步通过庆大霉素保护实验和免疫荧光实验研究MIR30B抑制自噬对胞内H. pylori的清除作用。获得以下研究结果：1.在H. pylori感染人胃上皮AGS细胞模型中，通过miRNA芯片和实时定量PCR观察到H. pylori感染后MIR30B表达上调；同时在人胃粘膜组织中得到了验证。2. H. pylori感染能够诱导AGS细胞自噬，电镜和庆大霉素保护性实验证实H.pylori能够在AGS细胞内存在，抑制自噬可促进H. pylori的胞内存活。3.预测并鉴定了MIR30B的靶基因：BECN1和ATG12，证实MIR30B通过转录水平抑制其靶基因从而扰乱自噬。4.与未感染H. pylori人群相比，感染阳性的病人自噬水平降低，同时MAP1LC3B的蛋白水平以及BECN1和ATG12mRNA表达量明显下降，并且与MIR30B呈负相关。5. MIR30B可通过抑制其靶蛋白有利于H. pylori在胞内的存活。固有免疫应答作为机体抵抗病原微生物感染的一种重要的防卫机制，在抵抗H.pylori感染中发挥重要的作用。髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MYD88)是Toll样受体信号转导通路中的一个关键衔接分子。研究表明MYD88参与调控H. pylori感染过程中的TLR信号通路。前期研究发现，在H. pylori感染所致炎症反应中，诱导宿主表达升高的MIR155能通过抑制靶蛋白的表达而负性调控促炎症因子的表达。生物信息学分析提示，MYD88可能是MIR155的靶蛋白。本文首先通过萤光素酶实验和荧光蛋白实验鉴定了MYD88是MIR155的靶蛋白，并采用Western-blot和实时定量PCR技术证实了MIR155通过抑制MYD88的翻译发挥作用；进一步，采用siRNA干扰技术、转染MIR155模拟物及抑制剂，通过ELISA和实时定量PCR技术分别在转录水平和蛋白水平检测促炎症因子IL-8的表达情况，证实MIR155在幽门螺杆菌感染中通过靶向抑制MYD88而负性调控炎症反应。