丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是重要的纤维素酶工业生产菌株。由于它卓越的产酶性能,近年来越来越多的研究将其作为异源基因的表达宿主。里氏木霉产生的内源纤维素酶数量较多,它们主要包括纤维二糖水解酶(外切葡聚糖酶)和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。本实验应用CRISPR/Cas9技术并结合RNAi干扰技术,敲除和干扰里氏木霉中的主要的纤维素酶基因,构建里氏木霉低纤维素酶表达菌株。实验还发现,以低纤维素酶背景菌株作为表达宿主,可以明显提高部分异源基因的表达水平。本研究进行了如下工作:1.应用CRISPR/Cas9技术敲除里氏木霉中主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术沉默内切葡聚糖酶eg2基因在里氏木霉中的表达应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。使用这种方法获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的转录水平较出发菌株SUS5降低了98%。2.在SUS6菌株中表达外源基因NfBgl3A以SUS6为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的beta-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U/mL,远高于以出发菌株(高纤维素酶背景)为宿主表达beta-葡萄糖苷酶酶活(两个代表转化子分别为11.6和31.9 U/mL)。然而,表达黑曲霉来源的甘露聚糖酶时酶活并没有明显的提高。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可选择性的显著提高某些异源基因的表达水平。3.在SUS6菌株的基础上应用CRISPR/Cas9技术敲除主要分泌蛋白木糖苷酶xyl3A和纤维素酶cbh2、eg1基因本实验在SUS6菌株的基础上,首先通过5-FOA反向选择,将木霉菌种的pyr4筛选标记去除,而后通过胞内表达Cas9核酸酶并结合gRNA的表达,敲除xyl3A基因,在48个转化子中筛选到一株xyl3A基因被敲除的菌株SUS7。再以SUS7菌株作为宿主菌,敲除pyr4筛选标记,后应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并结合同源重组臂,共同转化里氏木霉以分别定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh2基因以及内切葡聚糖酶eg1基因,进一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达体系。4.里氏木霉中基于CRISPR/Cas9的新型编辑方法的探索CRISPR/Cas9系统作为第三代基因组编辑技术,具有高效的基因编辑能力,但是当我们在里氏木霉中应用时,发现其效率仍然很低。针对这一问题,我们对CRISPR/Cas9系统从各个角度尝试进行改进,如对驱动gRNA的启动子的改造、对Cas9蛋白进行突变、加入非同源DNA、加入小分子物质、使用热胁迫条件等,以期提高CRISPR/Cas9系统在里氏木霉中的基因编辑效率。综上所述,本研究综合应用各种方法,构建了里氏木霉低纤维素酶背景的表达菌株;以构建过程中的菌株作为表达宿主,能明显提高某些异源基因的表达水平。此外我们还对一些新型的编辑方法进行了有益的探索。