目的肺腺癌转移能力较强,即使是在较早期也常出现淋巴结转移和/或血行转移,预后较差。因此,研究肺腺癌基因表达的差异,将有助于了解促进或抑制肺腺癌转移的相关机制,并有可能发现判断肺腺癌转移和预后的明确指标以及阻止肺腺癌转移的有效方法,进而提高肺腺癌的总体生存率。胚胎发育过程中,发育调控基因参与细胞生长、分化和凋亡的调节,不断按照预定程序表达和沉默。当这种有序的自稳状态一旦被破坏,即可导致包括肿瘤在内的许多疾病。而癌细胞的最基本生物学特征为细胞的增殖与分化的失调,细胞无限生长并具有永生性,呈现出原始的幼稚状态。新近的研究表明,某些发育调控基因参与了肿瘤的形成和发展过程,而一些癌基因或抑癌基因如c-mos、c-kit和Hox-11等本身就是发育调控基因。因此,有学者认为与肿瘤转移有关的基因链可能与胚胎发展和分化期的基因链相同,癌症就是基因的返祖现象。癌基因Wnt-1和转移抑制基因nm23-H₁同属于发育调控基因,均编码关键性调控蛋白,参与细胞的增殖、分化和凋亡。而在受到异常刺激激活或发生突变,其表达出现异常后,又都与多种肿瘤的发生发展、侵袭和转移有关。近年来的研究结果显示nm23-H₁基因可以通过阻断Wnt/β-catenin信号通路发挥抑制肿瘤转移作用;而Wnt基因又可能通过Wnt/Ca²⁺信号通路影响nm23-H₁基因的表达。目前,关于两基因与肺癌转移和预后关系的研究较多,但结果不一,且尚未见对二者同步检测的报道。为此,本研究在探索从福尔马林固定石蜡包埋组织标本中提取高质量RNA方法的基础上,应用RT-PCR及免疫组化技术同步检测了Wnt-1和nm23-H₁基因mRNA及其编码蛋白在石蜡包埋肺腺癌组织中的表达,探讨二者mRNA表达与其蛋白质表达之间的相关性和两基因表达之间的相关性以及二者的表达与肺腺癌生物学行为和预后的关系。同时,采用Wnt-1基因特异性siRNA转染的方法,抑制人肺腺癌细胞株A2中相应靶基因的内源性表达,以探讨Wnt-1基因对细胞生长和凋亡的影响。材料与方法一、实验材料48例肺腺癌为中国医科大学第一临床学院胸外科1998年1月至2000年9月收治,术前未经放、化疗,术后经病理证实,临床和随访资料完整的病例。其中,男28例,女20例,年龄35～76岁,平均57.7岁;术后生存时间≥3年者31例,＜3年者17例;PTNM分期（国际抗癌联盟,UICCl997）;Ⅰ期17例,Ⅱ期13例,Ⅲ期18例;淋巴结转移;阳性25例,阴性23例。另取12例癌旁肺组织做对照。人肺腺癌细胞株A2为中国医科大学肿瘤研究所保存。二、实验方法1、免疫组化法检测Wnt-1和nin23-H1蛋白在肺腺癌组织中的表达采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶连接（SP）免疫组织化学方法,一抗工作浓度为1;50。实验步骤按试剂盒说明书进行。Wnt-1和nm23-H₁阳性均定位于细胞质。Wnt-1染色强度0=无显色,1=微弱黄色,2=浅黄色,3=棕黄色,4=棕褐色。癌组织染色强度≥3或癌组织染色强度=2但阳性细胞百分率≥10%,均视为有表达。nm23-H₁染色阳性细胞数≥31%为染色阳性,＜30%为染色阴性。以PBS代替一抗作阴性对照。2、RT-PCR检测Wnt-1和nm23-H1基因在肺腺癌组织中的表达取100mg待检测石蜡标本组织,Trizol一步法提取总RNA,用DNA/RNA测定仪测定RNA浓度和纯度。反应体系中加入10×RNA PCR Buffer 1μl、dNTP 1μl、MgCl₂ 21μl、Random 9mers 0.5μl、RNA 1μl、RNAse inhibitor 0.25μl、ReverseTranscriptase 0.5μl、ddH₂O 3.75μl。反应条件;30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。Wnt-1引物（a;5’-TACCTCCAGTCACACTCCCC-3’;b;5’-CCATGGCAGGAGAATAGGAA-3’,348bp）,β-actin引物318bp,nm23-H₁引物（a;5’-GCAGCCGGAGTTCAAACCTA-3’;b;5’-CTGGGAGGAAGCATTTTATC-3’,273bp）,β-actin引物512bp。在12.5μl反应体系中含有灭菌ddH₂O 7.16μl、20mmol/L上、下游引物各0.15μl、cDNA2.5μl、Taq Hs 0.04μl、5×Buffer 2.5μl反应条件;94℃预变性2min,94℃40s,57℃40s,72℃1min,30个循环后,72℃延伸10min。100V,1.5h,电泳结束后,凝胶自动成像仪进行摄像分析。3、Wnt-1特异性siRNA转染人肺腺癌细胞株A2将细胞株培养于含有10%小牛血清的RPMll640培养液中,置于37℃,含5%CO₂的湿润空气的培养箱培养。每2d换新鲜培养液一次。细胞处于对数生长期时,用0.25%胰蛋白酶消化,待80%细胞伪足收缩后用含有10%小牛血清的RPMll640培养液终止消化,离心后弃上清,用培养液将沉淀调成细胞悬液,接种于12孔板中。加入不含抗生素和血清的RPMI1640培养液,置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中常规培养24h,再进行细胞转染。操作按Lipofectamine^tm200试剂说明进行;①把脂质体转染试剂轻轻混匀,在待转染的12孔板中依次加入不含抗生素和血清的98μL RPMI1 640、2μL Lipofectamine^tm200和0.8gg siRNA,使最终体积为100μL,用枪轻轻吹打混匀。②20℃孵育15分钟。③细胞培养箱内培养6小时后,每孔加入2ml新鲜细胞培养液继续培养。实验分4组,分别为空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组（Negative control）和实验组,每组设3个复孔;实验组每孔加入100μL转染复合物(0.8μg siRNA+98μL RPMI1640+2μL Lipofectamine^tm200);阴性对照组每孔加入100μL转染复合物(0.8μg N-siRNA+98μL RPMI1640+2μLLipofectamine^tm200);脂质体对照组每孔加入100μL转染复合物(98μLRPMI1640+2μL Lipofectamine^tm200);空白对照组每孔加入100μL RPMll640。转染后孵育6h,再更换含10%小牛血清的RPMI1640培养液继续培养。4、RT-PCR检测转染后Wnt-1基因mRNA表达的变化转染24h后,取1×10⁶细胞Trizol法提取总RNA。逆转录反应和PCR反应方法同前。5、Western印迹杂交检测转染后Wnt-1基因蛋白表达的变化取1×10⁶细胞,采用Folin-酚试剂法进行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳;NC膜转膜2h,加入Wnt-1一抗（1;400）和β-actin鼠抗人单克隆抗体（1;400）,室温孵育2h。加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔和马抗鼠单克隆二抗,室温孵育2h,碱性磷酸酶显色1 5min,于自动电泳凝胶成像分析系统下成像。6、MTT法检测细胞增殖收集对数生长期细胞,重悬后,取2×10⁵/mL密度接种于96孔板,每孔100gL。置37℃、5%CO₂温箱,无血清RPMI1640培养过夜使细胞贴壁。转染方法同前。分别于转染后24h、48h、72h加入80μL新鲜RPMI1640培养液,再加入20uL MTT溶液（5mg/mL）,继续培养4h。吸掉上清,每孔加入100ul二甲基亚砜。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值。7、流式细胞术检测A2细胞的凋亡水平转染后48h,制备各实验组细胞悬液,以PBS调整细胞数为1×10⁶/ml。加PI染色液（PI5mg,Rnase 2mg,TritonX-1001ml,生理盐水65ml,枸椽酸钠100mg,加蒸馏水至100m1）1ml,置4℃冰箱中避光染色30min后上机分析。所使用的流式细胞仪为FACSCalibur型（B.D,USA）。光源为488nm氩离子激光器,每份标本计数10000个细胞,然后在Macintosh 9.5计算机上用相关软件分析数据。测量前,以人淋巴细胞作为标准品调校仪器的CT值在3.0%以内。计算凋亡细胞所占的百分比。8、统计学分析采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学分析。计数资料采用X²检验和Fisher精确概率法;计量资料采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验组间差异的显著性;Cox比例危险度模型作为多因素预后分析。结果1、从石蜡包埋肺腺癌组织中提取的总RNA质量较高2.1＞OD₂₆₀OD₂₈₀＞1.8。2、48例肺腺癌中Wnt-1基因mRNA和其蛋白表达率分别为39.6%和43.7%,生存时间≥3年组其表达率（29.0%;32.3%）明显低于生存时间＜3年组（58.8%;64.7%）,P＜0.05。3、48例肺腺癌中nm23-H₁基因mRNA和其蛋白表达率分别为62.5%和68.8%,淋巴结转移阳性组其表达率（48.0%;52.0%）明显低于淋巴结转移阴性组（78.3%;87.0%）,P＜0.05;生存时间＜3年组其表达率（41.2%;41.2%）明显低于生存时间≥3年组（74.2%;83.9%）,P＜0.05。4、Wnt-1基因mRNA表达组中nm23-H₁基因mRNA表达率52.6%,Wnt-1蛋白表达组中nm23-H₁蛋白表达率61.9%,两基因表达之间无相关性,P＞0.05。5、多因素Cox回归分析显示TNM分期和nm23-H₁基因mRNA高表达反映肺腺癌预后情况,风险度分别为2.015和0.313。6、转染Wnt-1基因siRNA后,与对照组相比,实验组A2细胞对应靶基因mRNA表达和蛋白表达均有明显降低。7、转染Wnt-1基因siRNA后,A2细胞活力受到显著抑制（P＜0.05）,凋亡增加。结论1、Wnt-1基因的表达与肺腺癌患者生存时间有相关,阳性表达患者较阴性表达者的生存时间缩短。2、nm23-H₁基因表达与肺腺癌患者淋巴结转移和生存时间有关,阳性表达患者较阴性表达者淋巴结转移少,生存时间延长。3、Wnt-1基因表达和nm23-H₁基因表达无关。4、TNM分期和nm23-H₁基因mRNA高表达是肺腺癌独立的预后指标,以TNM分期为基础,检测nm23-H₁基因mRNA将有助于筛选出具有高转移危险的患者。5、抑制人肺腺癌细胞株A2细胞中Wnt-1基因的表达可以抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。