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乙肝病毒核心抗原（Hepatitis B Core Antigen，HBcAg）可以在原核表达系统表达并能形成病毒样颗粒（Virus Like Particles，VLPs），非常适合作为表位疫苗的载体。位于其衣壳表面刺突顶端的主要免疫显性区域(Major ImmunodominantRegion，MIR)允许一定程度的外源基因插入，而且可以将外源序列高密度并重复地暴露在其表面，诱发强烈的特异性细胞和体液免疫反应。本研究在以往研究的基础上，选择Ct MOMP免疫优势区的多个细胞表位，构建成串联表位，以HBcAg(MIR)为载体，通过原核表达串联表位蛋白，进行免疫保护作用研究。 目的: [1]构建以HBcAg(MIR)为载体的含E血清型Ct MOMP串联表位基因的重组质粒，并在大肠杆菌表达系统进行蛋白表达; [2]研究HBcAg(MIR)-MOMP串联表位蛋白的免疫原性，包括细胞免疫和体液免疫; [3]研究HBcAg(MIR)-MOMP串联表位蛋白对小鼠生殖道E血清型Ct攻击的免疫保护作用。 方法: [1]PCR扩增出E血清型Ct MOMP表位基因，插入到载体HBc的MIR区，构建3个重组质粒即pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1、pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2、pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3(以下蛋白简称MIR-Epi1、MIR-Epi(1+2)、MIR-Epi(1+2+3))。经PCR鉴定、DNA测序验证正确后，将3个重组质粒及pET21a/HBc(MIR)（以下蛋白简称MIR）转化入Rosetta菌株中，IPTG诱导表达蛋白，经Ni-NTA亲和层析法纯化，经WB检测成功后，进一步电镜观察进行鉴定; [2]选取6～8周龄的BALB/c雌性小鼠，随机分为7个组，分别为Ct MOMP(Epi1)合成肽、MIR-Epi1、MIR-Epi(1+2)、MIR-Epi(1+2+3)组，PBS和MIR组为阴性对照，灭活Ct组为阳性对照，每组10只。分别在1、3、5w时，皮下多点注射免疫，共免疫3次;0w、2w、4w、6w、8w时，断尾取血分离血清并采集生殖道分泌物，酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分别检测Ct特异性IgG和IgA。末次免疫后2w，用Ct MOMP CTL合成肽孵育小鼠脾细胞:以P815细胞为靶细胞，用LDH法检测试剂盒检测CTL的杀伤活性; [3]小鼠末次免疫后2周，以1×106 IFU的E血清型Ct对小鼠生殖道进行攻击。分析HBcAg(MIR)-MOMP串联表位蛋白对小鼠生殖道E血清型Ct攻击的免疫保护作用:①对小鼠外阴炎症进行观察和评分，并观察炎症的持续时间;②隔3天采集生殖道分泌物进行，计数CtIFU，以分析各组小鼠生殖道Ct清除率。 结果: [1]成功构建含表位基因的重组质粒pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1、pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2、 pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3,MIR-Epi1、MIR-Epi(1+2)、MIR-Epi(1+2+3)及MIR蛋白在大肠杆菌Rosseta中成功表达，WB证实获得了纯化的目的蛋白，均可在电镜下观察到形成的VLPs。 [2]免疫原性检测: 体液免疫:ELISA结果显示Ct MOMP表位蛋白免疫能刺激机体产生较高的Ct特异性IgG和IgA抗体水平。随着免疫次数的增加，抗体水平持续上升;均在第6周达到高峰。第6周时，单因素方差分析比较各组IgG抗体水平差异，MIR-Epi1组IgG抗体水平显著高于PBS组、MIR对照组及CtMOMP(Epi1)合成肽组(t1=25.442，P＜0.001;t2=23.839，P＜0.001;t3=19.297，P＜0.001)。MIR-Epil、MIR-Epi(1+2)、MIR-Epi(1+2+3)三组之间比较，MIR-Epi(1+2+3)组IgG抗体水平显著高于MIR-Epi1组（t=4.376，P＜0.05），MIR-Epi(1+2)组产生的IgG抗体水平显著高于MIR-Epi(1+2+3)组(t=11.668，P＜0.001);单因素方差分析比较各组间第6周时IgA抗体水平， MIR-Epi1组产生IgA抗体水平显著高于PBS组、载体MIR组和Ct MOMP(Epi1)合成肽组（t1=16.936，P＜0.001;t2=12.543，P＜0.001; t3=6.811，P＜0.01）。三个表位蛋白之间比较，MIR-Epi(1+2+3)组产生IgA抗体水平显著高于MIR-Epi1组(t=6.811，P＜0.01)，MIR-Epi(1+2+3)组与MIR-Epi(1+2)组之间比较无统计学意义（t=2.013，P＞0.05）。 细胞免疫:经LDH法检测CTL细胞杀伤活性，结果显示Ct MOMP CTL肽孵育脾细胞，在效靶比40∶1时，各组CTL细胞杀伤活性最高，单因素方差分析，各组进行比较，MIR-Epi1组CTL细胞杀伤活性显著高于PBS组和载体MIR组(t1=35.104，P＜0.001; t2=44.081，P＜0.001)，MIR-Epi(1+2)组CTL杀伤率显著高于Ct MOMP(Epi1）合成肽组和MIR-Epi1组(t1=5.314，P＜0.01;t2=9.147，P＜0.01)，MIR-Epi(1+2+3)组CTL杀伤率显著高于MIR-Epi(1+2)组（t=3.829，P＜0.05)。E∶T为20∶1时，各组间进行单因素方差分析，组间F=452.488，P＜0.001。比较各组CTL杀伤活性，MIR-Epi1组CTL杀伤活性显著高于PBS组和载体MIR组(t1=38.440，P＜0.001; t2=35.997，P＜0.001)，MIR-Epi(1+2)组CTL杀伤活性显著高于Ct MOMP(Epi1)合成肽组和MIR-Epi1组(t1=6.342,P＜0.01;t2=10.717,P＜0.001),MIR-Epi(1+2+3)组CTL杀伤活性显著高于MIR-Epi(1+2)组（t=3.441，P＜0.05）。 [3]免疫保护性检测: ①对小鼠外阴炎症进行观察:Ct感染后3天，各组小鼠出现不同程度的炎症表现，PBS组和载体MIR组在感染后第27天生殖道仍有红肿情况，CtMOMP(Epi1)合成肽和MIR-Epi(1+2)组在第27天时炎症消失，MIR-Epi(1+2+3)组和MIR-Epi1组炎症在第24天时炎症消失，灭活Ct组在第21天时炎症消失。②小鼠生殖道Ct清除率计算结果显示:MIR-Epi(1+2+3)和灭活Ct组的Ct清除率在第18天时为0，MIR-Epi(1+2)组清除率在第21天时为0，MIR-Epi1组第24天时接近0，而PBS组、Ct MOMP(Epi1)合成肽和MIR组的清除率在27天时为0。说明HBcAg(MIR)-Ct MOMP串联表位蛋白免疫小鼠清除生殖道Ct效果较好，比1个表位蛋白的免疫原性强; 结论: [1]成功构建重组质粒pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1、pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2、pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3，原核表达量较高，并在负染电镜下观察到直径约22nm的VLPs; [2]HBcAg(MIR)-MOMP串联表位蛋白可诱导小鼠产生Ct特异性的IgG及IgA抗体，可以有效刺激小鼠产生Ct特异性的CTL反应，具有较强的免疫原性。且HBcAg(MIR)-MOMP串联表位蛋白比1个表位蛋白的免疫原性强; [3]HBcAg(MIR)-MOMP串联表位蛋白组对小鼠生殖道Ct攻击具有较强的免疫保护作用，HBcAg(MIR)-MOMP串联表位蛋白比1个表位蛋白免疫保护性强。