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乏氧是实体肿瘤组织微环境中的一个重要现象。乏氧肿瘤细胞对放射治疗、化学治疗的耐受性增强。乏氧肿瘤细胞的存在是患者恶性肿瘤治疗失败、复发和转移的重要原因之一。在乏氧细胞中，许多基因呈乏氧依赖性表达，包括血管生成相关基因、葡萄糖转运相关基因、糖酵解相关基因、红细胞生成相关基因以及凋亡相关基因等。乏氧诱导的转录因子-1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)介导了其中绝大部分基因的转录活化。 p53是许多实体肿瘤中发生了突变的一个抑癌基因，p53功能的丧失与细胞的恶性表型密切相关，而乏氧可增强这一作用。通常认为，野生型p53可以抑制HIF-1介导的乏氧依赖性基因表达，而突变型p53则不具备这种作用。但也有研究显示，乏氧诱导的VEGF表达与细胞内p53的功能状态无关。新近研究表明，HIF-1可与p53直接结合，HIF-1也可以结合Mdm2。提示，p53与HIF-1或HIF-1介导的乏氧依赖性基因的表达有着某种联系。 乏氧细胞的基因表达与正常细胞有着很大的差异。这些差异使得针对肿瘤乏氧细胞的靶向性治疗成为可能。多数乏氧依赖性第四军医大学博士学位论文基因的共同特点是其调控区内含有乏氧反应元件(hypoxia一responsive element，HRE)。1 997年，小鼠磷酸甘油激酶基因的HRE被成功用来引导目的基因在乏氧肿瘤细胞中的特异性表达。之后，来自于多种乏氧依赖性基因(包括VEGF和EPO)的HRE被成功用于乏氧依赖性的基因特异性表达。但这些乏氧靶向性的基因治疗用于实体肿瘤的疗效有限，仍有待于进一步研究探讨。 目的: 1.探讨p53对乏氧诱导基因表达的影响。 2.构建乏氧依赖性表达的腺病毒载体，借助该载体引导自杀基因BCD(细菌胞普脱氨酶，可将无毒性的前体药物5一氟胞咯睫转变为细胞毒性药物5一氟尿嗜睫)在乏氧肿瘤细胞的特异性表达，观察该乏氧细胞靶向性自杀基因系统的抗肿瘤效应，并观察该系统对放射治疗的增强效应。 方法: 第一部分:p53对乏氧诱导基因表达的影响 一、借助p53表达缺失的saosZ细胞与调控型p53表达载体研究野生型p53对乏氧诱导基因表达的影响 1.四环素调控的质粒pTREZwt一p53的构建及鉴定:用盯一PCR扩增野生型p53 cDNA片段，并将其克隆入pTREZhyg载体。重组质粒经限制酶切鉴定和DNA序列测定证实。 2.saOSZ细胞Tet一Off稳定克隆的建立:将pTet一off载体转染SaOSZ，利用G一418筛选获得稳定克隆。借助双荧光素酶检测系统筛选表达高水平Tet一Off的SaosZ细胞亚系SaOSZ/Tet一off。 3.SaOSZ/Tet一off细胞瞬时转染和报告基因试验:将PSHRE小CMVmp一luc、pRL一CMv以及不同剂量的pTREZwt一p53共转染入saOSZ汀et一Off细胞。对转染细胞进行6h的乏氧处理后，检测荧光第四军医大学博士学位论文素酶活性。 二、借助人纤维肉瘤HT1080细胞的两个同基因亚系P48和6TG研究内源性p53对乏氧诱导基因表达的影响 1.p53在P48细胞和6TG细胞的表达鉴定:对P48细胞和6TG细胞进行4Gy的照射或6h、18h的乏氧处理，利用Westernblot检测p53及其下游靶分子pZI的表达。 2.P48和6TG细胞瞬时转染和报告基因试验:将p5HRE/h CMVmp一lue和pRL一CMV共转染入p48细胞或6TG细胞。对转染细胞进行6h、18h的乏氧处理后，检测荧光素酶活性，并计算每种细胞乏氧条件下荧光素酶活性与正常氧条件下荧光素酶活性的比值(H/Aratio)。 3.VEGF mRNA在P48细胞和6TG细胞的乏氧诱导性表达:对P48细胞和6TG细胞进行1 sh的乏氧处理，利用Northernblot检测VEGF mRNA的表达水平。 第二部分:腺病毒载体介导的肿瘤乏氧靶向性基因治疗 一、乏氧依赖性腺病毒载体Ad一SHRE/hcMvmp一BCD的构建及鉴定 1.质粒p5HRE/hCMVmp一BCD的构建与鉴定:通过pCR扩增BeD(baeterial eytosine deaminase，细菌胞昔脱氨酶)eDNA，将其克隆入质粒载体pEF/myc/cyto，并使BCD与c一Myc融合为BCD一c一Myc，以方便BCD的检测。借助DNA重组技术，将BCD一e一Mye融合基因从pEF/mye/eyto质粒亚克隆入p5HRE/hCMVmp一Lue，并使其替换p5HRE/hCMvmp一Lue中的Lue，构建成p5HRE/hCMVmp一BCD。 2.粘粒pAxew一SHRE/hCMVmp一BCD的构建与鉴定:借助DNA重组技术，将5 HRE/heMvmp一BeD eDN^片段从质粒p5HRE/heMVmp一BCD亚克隆入粘粒pAxcw，构建成第四军医大学博士学位论文pAxcw一SHRE/heMVmp一BCD。通过目的基因的pCR扩增、限制酶切和DNA序列测定鉴定重组粘粒。 3.重组粘粒pAxcw一SHRE/hCMVmp一BCD的功能鉴定一乏氧诱导的BCo表达的检测:将粘粒pAxew一SHRE/hCMVmp一BCD转染HT 1 080细胞，并对细胞进行乏氧处理，利用NorthernBlot和Western Blot分别检测BCD mRNA和蛋白的表达水平。 4.腺病毒载体Ad一SHRE/hCMVmp一BCD的构建:借助重组粘粒pAxew一SHRE/heMVmp一BCD和包装细胞293细胞，按照COS一TPC方法制备腺病毒载体Ad一SHRE/hCMVmP一BCD。 二、腺病毒载体Ad一SHRElhcMvmp一BcD的离体功能检测 1.乏氧诱导的BCD蛋白表达的检测:用Ad一SHRE/hcMVmp一BCD感染Hcla细胞，并对细胞进行乏氧