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研究背景:超声能够穿透较长距离而能量衰减比较少,可以精确地聚焦于局部组织,这使得超声具有更广泛的应用:超声能够无创治疗某些疾病如结石、肿瘤,超声在医学上最常见的应用是诊断成像。在中枢神经系统,超声能进行无创切除颅内部分组织而治疗帕金森病、改善抑郁症症状等。而且,强度适中的超声波可以在不杀死神经元的情况下增强或抑制神经元活性,在治疗运动障碍、抑郁症、焦虑和一些难治性神经精神障碍上具有很大潜力,所以近年来超声用于无创调节神经元活动成为神经领域研究的新方向。动物的在体实验表明超声作用于运动皮层可诱发肌肉收缩和肢体运动,作用于感觉皮层能引起相应的感觉,这使得超声进行无创脑刺激成为可能。目前认为超声引起生物学效应更有可能是通过超声的机械力作用而非热效应,超声能开放异源表达在蛙卵细胞膜上的机械敏感通道(双孔钾通道)引起电流,但超声对神经系统的效应是否也是通过机械敏感通道作用,通过哪一种机械敏感通道起作用,目前还没有这方面的报道。囊性纤维化转导调节因子(CFTR)作为阴离子通道可介导氯离子进出细胞膜,有报道表明CFTR具有机械敏感性,可以感受细胞膜形变而引起电流。由此我们推测,超声能开放CFTR通道,并且CFTR通道参与超声对神经细胞的作用,是超声神经调控的细胞和通道机制之一。方法:本研究设计分四部分实验,分别是超声对野生型神经元的作用;CFTR通道在超声调控野生型神经元中的作用;超声对CFTR基因敲除神经元的作用;超声对CFTR转染HEK293细胞的作用。首先,C57胎鼠皮层神经元原代培养,采用电生理实验,记录超声刺激对神经元放电和诱发电流的影响;采用c-Fos免疫荧光染色的方法,对比超声刺激对c-Fos蛋白表达的影响。第二,通过CFTR免疫染色和免疫印迹法验证CFTR在小鼠皮层神经元的表达;加入CFTR阻断剂GlyH101后超声对培养神经元放电频率和诱发电流的影响,以及加入GlyH101后超声对c-Fos蛋白表达的影响。第三,全细胞电压钳下检测超声对CFTR基因敲除小鼠(CFTR-/-)皮层神经元诱发电流的作用;检测超声刺激对CFTR敲除神经元c-Fos蛋白表达的影响,并将获得结果与野生型神经元对比。最后,使用瞬时转染方法将CFTR蛋白表达于HEK293细胞,通过膜片钳方法检测超声对表达CFTR的HEK293细胞的作用。结果:1、超声刺激增加小鼠皮层神经元放电频率(细胞外和细胞内记录),与超声刺激前相比p<0.001;超声刺激诱发神经元产生内向电流(电流频率与超声刺激前相比p<0.05);超声刺激增加神经元c-Fos蛋白表达(荧光强度与超声刺激前相比p<0.01)。2、免疫荧光染色和实时荧光定量PCR法证实离体培养的小鼠皮层神经元有CFTR蛋白表达,免疫印迹法也显示小鼠皮层组织有CFTR蛋白表达。CFTR阻断剂GlyH101能抑制超声刺激引起的神经元放电(放电频率与加阻断剂前相比p<0.001),抑制超声刺激诱发神经元的内向电流(电流频率与加阻断剂前相比p<0.01),减少超声造成的c-Fos蛋白表达增加(荧光强度与加阻断剂前相比p<0.05)。3、与野生型神经元相比较,超声刺激CFTR基因敲除小鼠神经元产生的电流频率明显减少(p<0.05)。与野生型神经元相比较,超声刺激CFTR基因敲除小鼠神经元造成的c-Fos蛋白表达明显减弱(p<0.05)。4、超声刺激诱发CFTR转染的HEK293细胞产生内向电流,该电流能被CFTR阻断剂GlyH101阻断(电流频率与加阻断剂之前相比p<0.01)。结论:本研究表明,超声能够激活离体培养的小鼠皮层神经元;小鼠皮层神经元有CFTR蛋白表达;超声能够通过CFTR激活小鼠皮层神经元;敲除神经元的CFTR能减弱超声对神经元的激活作用;表达CFTR能使HEK293细胞获得对超声的反应;所以CFTR参与超声激活离体培养的皮层神经元。