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光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）是利用光敏剂经特定波长光活化产生活性氧,对肿瘤或特定部位细胞进行杀伤,进而治疗多种疾病的新方法,尤其是在皮肤病及浅表肿瘤的治疗中发挥重要作用。二氢卟吩类光敏剂作为二代光敏剂的典型代表,因其具有吸收波长大、吸光系数高、清除速率快、结构多样等优点,成为新型光敏剂研究的热点。在肿瘤光动力治疗研究中发现,肿瘤组织经光动力治疗后细胞内组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetyases,HDAC）活性显著升高,而组蛋白去乙酰化水平下降,进而可能引起肿瘤细胞的快速增殖及导致肿瘤的复发和转移,是目前临床上光动力疗法面临的重要问题之一。如果能够利用药物分子设计或新型载药体系实现HDAC抑制剂（Histone deacetylase inhibitors,HDACis）与光敏剂共同给药,可以结合HDACis与光动力疗法的不同作用机制,有望提升单一治疗模式的抗肿瘤活性,发挥协同增效作用,达到更好的治疗效果。本论文的工作分为两部分内容:（1）首先我们尝试以二氢卟吩类光敏剂焦脱镁叶绿酸a为原料,与经典的HDACis辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）共价交联合成新型双模小分子药物,以期实现药物的一体多效和不同抗肿瘤机制的协同作用,并初步研究了其对肿瘤细胞的杀伤效果;（2）为克服光敏剂和HDACis两种药物溶解性差、体内半衰期短的缺点和提高二者的共同给药效率和以及增强靶向性,我们设计合成了具有叶酸靶向、肿瘤部位pH敏感释药并共价结合HDACis西达本胺的自组装纳米胶束药物联合递送系统。在胶束形成时通过胶束内部疏水作用实现光敏剂焦脱镁叶绿酸a的共载药,最终达到光敏剂与HDACis靶向共同给药,协同增效等目的,并通过体外细胞实验和荷瘤小鼠体内实验验证了其抗肿瘤作用。一、小分子双模抗肿瘤药物的合成、表征及活性探究本部分首先以叶绿素a为原材料,经过两步酸降解反应得到二氢卟吩类光敏剂焦脱镁叶绿酸a,然后用含有氧化还原响应型二硫键的胱胺将光敏剂与HDACis（SAHA）共价交联,合成了兼具光、化疗抗肿瘤活性的新型Chlorin-SS-HDACis双模小分子化合物。合成的Pha-SS-SAHA化合物与原光敏剂Pha的紫外吸收图谱相比,其最大吸收波长有9 nm的蓝移,组织穿透性有所下降。体外抗肿瘤实验结果显示,Pha-SS-SAHA可有效的杀伤小鼠黑色素瘤细胞B16-F10,根据CCK-8法测定结果计算出未经光照条件下Pha-SS-SAHA、Pha和SAHA的IC50值分别为9.505±0.540μM、7.171±0.400μM和4.576±0.609μM,Pha-SS-SAHA相比原光敏剂其暗毒性有所下降。经10J/cm2光照条件下Pha-SS-SAHA、Pha的IC50值分别为0.821±0.051μM、0.499±0.018μM。当分别给予1μM Pha-SS-SAHA、Pha或SAHA时,经10 J/cm2光照后,对孵育24 h的B16-F10细胞凋亡情况进行检测,细胞坏死的比例分别为65.54%、92.01%、17.12%。与原光敏剂Pha相比,Pha-SS-SAHA对肿瘤细胞的光毒性降低,这可能与SAHA对Pha的卟吩环产生空间位阻,影响ROS的生成有关。更大的可能是共价键的交联影响了光敏剂分子的有效释放,该策略或交联方法不太适合该两种药物的共同给药。因此,这也是我们开展本论文第二部分工作的重要原因。二、叶酸靶向的pH响应型高分子双模抗肿瘤胶束的合成、表征及活性研究西达本胺是一种苯甲酰胺类HDACis,是我国首个自主知识产权的该类原创新药。本部分研究中我们设计了一种具有pH响应性的共载药纳米胶束Pyropheophorbidea@Folate-Polymer polyethylene glycol-b-poly（aspartic acid）-Chidamide（Pha@FPPC）,首先将西达本胺接枝到pH响应型嵌段聚合物PEG-b-PAsp上,同时在聚合物的头部缀合叶酸（FA）作为靶头,增加药物传递系统的靶向性。在该两亲性嵌段共聚物FPPC通过自组装作用形成胶束时,难溶性的光敏剂脱镁叶绿酸a可通过疏水相互作用封装于胶束内部,形成共载药纳米胶束Pha@FPPC。该共载药胶束可实现光敏剂与西达本胺的共同靶向给药和肿瘤部位响应性释放,有望起到不同抗肿瘤作用机制的协同作用。（1）以L-天冬氨酸β苄酯（H-Asp（OBzl）-OH）为原料经过分子内环化反应,分子间聚合反应,水解反应制得FA-PEG-Pasp。然后以2-（7-氧化苯并三氮唑）-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）为缩合剂酰胺键共价结合西达本胺,制备得到两亲性嵌段聚合物FPPC。1H-NMR表征表明FPPC同时含有西达本胺与FA-PEG-Pasp的特征吸收峰,证明高分子材料的构建成功。该高分子材料FPPC在PBS溶液中可通过自组装形成胶束,过程中可利用疏水相互作用将Pha封装于胶束内部,完成叶酸靶向pH响应型高分子双模抗肿瘤的胶束Pha@FPPC的构建。（2）分别对载药胶束与空白胶束的载药量、粒径和Pha的pH响应释放进行检测。经测定胶束中Pha的载药量为4.67%,通过透射电镜对空白胶束和载光敏剂胶束的微观形态观察发现空白胶束粒径在83nm左右,载药胶束粒径在91 nm左右,均具有规则的球状形貌。载药胶束在pH 5.2和pH 7.4条件下的72 h释放量分别为60.70%和47.75%,具有较好的pH响应性。（3）利用体外细胞杀伤实验分别测定了Pha@FPPC对A2780、B16-F10和HUVEC三种细胞的体外光动力治疗效果,结果显示,相比于模型光敏剂Pha,Pha@FPPC均具有更低的暗毒性与更高的光毒性(在B16-F10细胞系中,光毒性的IC50值由0.186μM降至0.169μM,暗毒性的IC50值则由4.722μM上升到34.614μM,暗毒性/光毒性提升了8倍)。在细胞水平考察了Pha@FPPC对B16-F10的体外靶向性及细胞摄取能力。利用Pha自身的红色荧光,通过激光共聚焦显微镜对使用相同Pha浓度的Pha@FPPC、Pha@PPC和Pha孵育的肿瘤细胞进行观察,根据红色荧光强度确定三种给药方式的靶向性及摄取能力,结果显示Pha@FPPC>Pha@PPC>Pha。采用流式细胞技术分别从细胞凋亡水平、ROS产率及周期阻滞效果三方面对Pha@FPPC的抗肿瘤活性和机制进行评价。在光照条件下,给药浓度（按Pha计算）为0.1μM时,Pha@FPPC引起B16-F10细胞坏死比例高达95.45%,ROS平均产率为550.16,而单纯Pha诱导细胞坏死比例仅52.36%,ROS平均产率330.35,相比于模型药物Pha,Pha@FPPC将光动力杀伤的效果提升了近一倍。空白胶束FPPC对肿瘤细胞的G1/G0期产生阻滞作用,游离Pha主要将肿瘤细胞的阻滞在G2期,Pha@FPPC对肿瘤细胞的G1/G0和G2期均表现有的阻滞作用,表现出了Pha和西达本胺各自的细胞周期阻滞特征,表明该共载药胶束发挥了PDT与HDACis双重抗肿瘤作用。（4）在动物水平上进一步考察了Pha@FPPC的体内光动力抗肿瘤效果,实验采用C57小鼠,在每只小鼠右后肢接种1×105个B16-F10细胞,建立小鼠荷瘤模型。设立对照组（生理盐水）和实验组（Pha@FPPC组、Pha@PPC组、Pha组及FPPC组）五组,每组5只小鼠。各实验组在肿瘤接种第8天按Pha浓度为1 mg/kg进行尾静脉注射,45 min后对小鼠肿瘤部位激光照射360 s（光强度合计90J/cm2）。测量各治疗组小鼠肿瘤体积及小鼠生存情况,结果显示:Pha@FPPC给药组小鼠肿瘤的体积最小,生存时间最长,与对照组（p<0.001）、Pha给药组（p<0.01）和FPPC给药组（p<0.05）的治疗效果相比均具有显著差异。同时对各组死亡小鼠的肺组织切片进行H&E染色观察,结果显示生理盐水组与Pha组均出现多个的黑色素瘤肺部转移灶,而其他接枝有西达本胺的处理组未发现转移,显示出西达本胺对黑色素瘤细胞的转移具有较强的抑制作用。本研究成功合成出一种氧化还原响应性小分子双模抗肿瘤药物Pha-SS-SAHA,表现出一定的抗肿瘤活性,但同时发现光敏剂分子Pha的光动力活性有所下降。同时成功的构建了一种pH响应性共载药纳米胶束Pha@FPPC,该Pha和西达本胺共载药胶束不仅表现出良好的pH响应性和靶向性,还显示出良好的抗肿瘤活性。该共载药体系实现了肿瘤部位的“时空”释放,降低了光敏剂的毒副作用,同时延长了西达本胺的半衰期,提高了其生物利用度。本课题探索了PDT联合用药新模式,显示出Pha@FPPC胶束具有抑制肿瘤复发和转移的潜力,为临床解决PDT后肿瘤复发和转移问题提供重要参考。