肝素(heparin)和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)是一类由糖醛酸和氨基己糖组成的线性聚阴离子糖胺聚糖类(glycosaminoglycans, GAGs)大分子。除肝素和HS外,糖胺聚糖还包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等,而其中肝素和HS是糖胺聚糖中结构最复杂的成员。在体内,肝素主要由肥大细胞合成和贮藏,而HS则主要作为硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)的组成部分,广泛表达于各类细胞表面和组织基质中。肝素或HS的糖链结构与长度均有所不同,其二糖单元亦可进行不同程度的N-或D-硫酸化,因此肝素和HS常表达为多样化的复杂结构。结构的多样化赋予这类分子特异性或非特异性地结合多种宿主或外源蛋白质的能力,从而在生物体内表现出多样的生物功能。肝素和HS参与体内的多种生物过程,包括抗凝血、抗感染、炎症反应、肿瘤细胞转移、细胞黏附和细胞分化等。越来越多的不同种类的传染性微生物对宿主的黏附、胞内化或在体内的转移被证实可以被肝素或HS降低。肠道条件致病菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、单核细胞增生李斯特菌等对肠道细胞或黏液层的黏附等已报道可被肝素降低。而肝素对肠道致病菌沙门菌、志贺菌等对肠道上皮细胞或黏液层的黏附的影响尚未见有报道。因此,本课题钊对肠道致病菌,以大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和志贺菌为模型菌,对肝素抗肠道感染做一综合研究,以期为肝素在抗肠道感染方面的新药开发提供依据。与肝素对致病菌黏附影响的大量报道不同,肝素对益生菌定殖的影响的研究极少报道。肝素对益生菌黏附肠道上皮细胞和黏液层的影响尚需进一步研究。本课题以广泛使用的鼠李糖乳杆菌LGG (Lactobacillusrhamnosus GG)为研究对象,探讨肝素对其黏附的影响和可能的机制。以往肝素的抗炎作用的研究,注意力集中在肝素与人体细胞的相互作用上,且用药途径多为注射。肝素对肠道菌群的影响尚未有报道。针对肠道炎症或肠道感染,口服肝素可能具有独特的优势,并且肝素可能通过影响肠道菌群进而发挥作用。因此,本课题以大鼠为动物模型,研究了肝素对肠道菌群的影响,并提出肝素可作为一种有效肠道菌群调节物质,起到益生元的作用。1肝素对几株肠道致病菌和益生菌黏附作用的影响的体外研究目的考察体外肝素对常见肠道致病菌和益生菌黏附及定殖的影响。方法分别以HT-29单层细胞培养为肠道上皮细胞模型,固定化黏液素为黏液层模型,考察肝素对肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、金黄色葡萄球菌、沙门菌和志贺菌等常见肠道致病菌以及益生菌鼠李糖乳酸杆菌LGG黏附肠道上皮细胞和黏液层的影响。同时,通过LGG和EPEC黏附肠道上皮细胞的竞争、取代和抵御实验,探讨肝素与LGG有无协同作用及肝素抗感染的可能机制。此外,通过肝素对LGG生物膜形成能力的考察,进一步评价肝素对益生菌定殖的影响。结果肝素可抑制EPEC对HT-29细胞和黏液层的黏附,其中对EPEC黏附HT-29细胞的抑制作用表现出剂量效应。当浓度≥50μg/mL时,肝素即可达到显著抑制效果。肝素对肠道致病菌黏附HT-29细胞的抑制作用有一定选择性,除EPEC外,还可以抑制金黄色葡萄球菌的黏附,但对沙门菌和志贺菌则无明显作用。此外,肝素对益生菌LGG的HT-29细胞和黏液层黏附均无显著影响。在竞争和抵御实验中,当LGG浓度较低时,LGG与肝素联合应用可显著增强对EPEC黏附HT-29细胞的竞争和抵御作用：而LGG浓度较高时,肝素的效果相对不明显。肝素对LGG取代黏附EPEC无明显作用。在LGG生物膜形成实验中肝素可显著增强LGG的生物膜形成,生物膜生成量提高约30%。结论肝素具有选择抑制病原菌黏附HT-29细胞和黏液层的能力,其作用机制主要是外源肝素竞争或封闭细菌黏附结构。这种选择性抑制黏附的能力赋予肝素在防止肠道细菌感染和辅助治疗肠道感染方面潜在应用价值。另外,由于肝素携带大量负电荷,可以促进LGG形成生物膜从而利于益生菌定殖,我们提出肝素作为益生因子,与LGG协同使用,发挥更好的效果。2肝素对肠道菌群的影响的体内研究目的考察口服肝素及heparosan(未硫酸化的肝素前体)对大鼠肠道菌群及其主要组成细菌类群的影响及可能机制。方法实验大鼠随机分为5组,即生理盐水组,肝素-低剂量组、肝素-高剂量组、heparosan-氏剂量组和heparosan-高剂量组。每组均以灌胃方式给药,其中低剂量组按照5mg/kg体重,高剂量组按照10mg/kg体重,分别给予肝素或heparosan;生理盐水组灌胃等体积生理盐水。每日上午给药,持续进行14d。收集第14日粪便提取总DNA后,采用16S rRNA V3可变区通用引物或乳杆菌、拟杆菌及梭菌特异性引物PCR扩增16S rRNA。所得PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和主成分分析。差异条带切胶回收并克隆测序。结果肝素和heparosan可显著改变大鼠肠道菌群的优势细菌组成。与生理盐水组相比,肝素组或heparosan组乳杆菌的比例显著提高,而粪肠球菌比例下降。进一步的菌属特异性16S rRNA PCR-DGGE及测序结果显示,粪便中乳杆菌组成较为简单,肝素或heparosan组的L. taiwanensis和L. gallinarum组成增加。肝素或heparosan也会导致粪便的拟杆菌组成发生变化,但这种变化与肠道菌群病理变化的关系尚不清楚。此外,口服肝素或heparosan均未观测到直肠出血等不良作用。结论肝素和heparosan可选择增殖肠道内乳杆菌,使L. taiwanensis和L.gallinarum等乳杆菌相对比例提高,而乳杆菌等益生菌增多有利于维持稳定、健康的肠道菌群平衡。因肝素和heparosan对肠道菌群表现出类似的调节效果,我们推测肝素或heparosan的调节机制主要是由于其多糖骨架。经肝素或heparosan调节的肠道菌群,对肠道致病菌的抵抗能力有所增强。因heparosan可经细菌发酵获得,同时没有抗凝血等功能,在开发肠道菌群调节制剂时可能比肝素更有优势。