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目的:通过网络信息学预测黄芩抗克罗恩病结肠纤维化的治疗靶点,用不同浓度黄芩苷干预体外原代培养大鼠结肠成纤维细胞,通过检测细胞中相关蛋白的表达水平揭示黄芩有效部位抗克罗恩病结肠纤维化的分子机理。 方法: 1.从台湾TCM资料数据库中收集黄芩化学成分信息,运用Drugbank数据库基于结构相似性原理筛选与黄芩化学结构相似度超过≥0.8的药物,预测其作用靶点。运用OMIM数据库检索与纤维化疾病相关的蛋白分子,借助STRING数据库和Cytoscape可视化软件构建化学成分-药物靶点-疾病蛋白网络图计算网络拓扑特征值,分析预测黄芩治疗纤维化的关键蛋白。通过京都基因与基因组百科全书(KEGG Pathway)对靶点进行信号通路富集分析,预测黄芩有效部位抗纤维化疾病的关键信号通路。 2.采用胰酶联合差速组织块贴壁培养法原代培养结肠成纤维细胞,用HE染色和免疫组织化学法对其进行鉴定。以不同浓度黄芩苷干预结肠成纤维细胞,ELISA检测细胞培养基上清中TGF-β1含量,Western Bloting检测细胞中TGF-β1、ERK1/2和CTGF蛋白的表达水平。 结果: 1.黄芩抗器官纤维化作用靶点预测结果显示,数据库中检索到的58种黄芩化学成分中、黄芩素、豆甾醇-β-D-葡萄糖苷、圣草酚-7-3-葡萄糖苷、7,3,4-三羟基黄酮和5,7,2-三羟基黄酮与器官纤维化疾病密切相关。这几种化学成分主要通过MAPK信号通路、TGF-β信号通路、PI3K信号通路和细胞因子及受体的相互作用中包括PRKCA、PIK3CG、JAK1, FGFR1, GRB2, HSP90AA1, HSPA2, ITGAV、ITGB6, LPAR1、CDK6、PDGFRA、BCL2L1, TGF-β1, TLR4, TNF, PDGFB, PRKACA, PPP3R1, PPP3CA, INS, MAPK1,CTGF和ERK1/2等蛋白靶点发挥抗器官纤维化的作用。 2.采用胰酶联合差速组织块贴壁培养法成功原代培养大鼠结肠成纤维细胞,经HE染色观察细胞形态学特征,免疫组织化学法观察细胞中波形蛋白(Vimentin),平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙离子结合蛋白A4(S100A4)和钙黏蛋白(E cadherin)的表达并与平滑肌细胞对比鉴定出细胞中不含其他杂细胞。 3.不同浓度黄芩苷干预结肠成纤维细胞24h、48h和72h后,MTT结果表明黄芩苷对结肠成纤维细胞有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性关系。统计学分析表明,不同干预时间的细胞抑制率存在差异,黄芩苷干预后24h与48h比较有显著性差异(P<0.01),24h与72h比较有显著性差异(P<0.01),但48h与72h之间无统计学意义(P>0.05)。 4.ELISA结果显示不同浓度黄芩苷干预结肠成纤维细胞48h后,细胞培养基中TGF-β1含量显著降低,黄芩苷高浓度组与空白组有显著性差异(P<0.01),与阳性药组比较有显著性差异(P<0.01);黄芩苷中浓度组、低浓度组与阳性药组比较有统计学意义(P<0.05)。 5.Weatern bloting结果显示:黄芩苷干预结肠成纤维细胞48h后,TGF-β1蛋白表达水平明显下降,黄芩苷高浓度组与空白组比较有显著性差异(P<0.01),与阳性药组比较有显著性差异(P<0.01);黄芩苷中浓度组、低浓度组与阳性药组对比有统计学差异(P<0.05)。 加药干预48h后结肠成纤维细胞中ERK1/2蛋白表达水平均有不同程度下调,黄芩苷高浓度组、中浓度组和低浓度组与空白组比较,均有显著性差异(P<0.01),与阳性药组比较有显著性差异(P<0.01)。 加药干预48h后结肠成纤维细胞中CTGF蛋白表达水平均有下降,黄芩苷三个浓度组、阳性药组与空白组对比,均有显著性差异(P<0.01)。黄芩苷高浓度组与阳性药组比较有显著性差异(P<0.01);黄芩苷中浓度组、低浓度组与阳性药组比较无显著性差异(P>0.05)。 结论: 黄芩苷可有效减低TGF-β1在大鼠结肠成纤维细胞内的表达和细胞外分泌情况,通过下调TGF-β信号通路来抑制成纤维细胞的异常增殖,进而起到治疗克罗恩病结肠纤维化的作用,这与网络药理学的预测结果相符合。