论文部分内容阅读
研究背景中国一直以来都是食管癌(esophageal cancer,EC)发生的高发地区,约占世界的50%以上,而且病理类型以食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)为主。中国癌症登记年报2016年报告表明,中国食管癌2012年年发病率为20.35/100,000,在恶性肿瘤中的排名是第6位。死亡率在恶性肿瘤中排第四位,年死亡率为15.17/100,000。在中国,男性食管癌患者有176,000名,发病率是22.9/100,000,死亡人数是14.4万,死亡率为18.7/100,000。83,000女性食管癌病人,发病率是10.5/100,000,死亡人数是67,000。死亡率为8.2/100,000。约50%的食管癌患者临床发现时已经没有手术可能,目前Ⅱ期、Ⅲ期食管鳞癌5年生存率约20.64-34%。大多数患者术后3年内复发和转移,因此需要综合治疗来提高食管鳞癌的生存率。国内广州中山肿瘤医院牵头的多中心临床研究(NEOCRTEC5010)结果证实术前新辅助放化疗治疗可以提高局部晚期食管癌的手术切除率和生存时间。因此,提高食管鳞癌的化疗结局,不仅可以为晚期食管鳞癌患者带来美好的希望,同时可以使更多的局部晚期食管鳞癌病人从综合治疗中获的益处。顺铂(Cisplatin,DDP)是一种含铂的金属络合物,含铂联合化疗的方案是晚期食管鳞癌的基本治疗方法,也是局部晚期食管鳞癌术前新辅助治疗的重要方案之一。DDP作用机制为与细胞的DNA形成DDP-DNA络合物,使DNA复制受到细胞周期非特异性细胞毒性药物的干扰。但其治疗食管鳞癌的有效率只有40%-60%,DDP化疗耐药是影响治疗食管癌治疗效果的“瓶颈”。因此,对食管鳞癌DDP化疗耐药机制的理解,有助于逆转食管鳞癌对DDP耐药性,对提高食管鳞癌综合治疗的效果意义深远。近几年,已经发现的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)参与多种恶性肿瘤的化疗耐药机制,如在乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌当中均有发现。此外,血浆中检测的某些lncRNAs表达水平与食管癌中的根治性放化疗敏感性相关,lncRNAs可以作为生物标记物,用于评估患者是否从放化疗中获益。但lncRNAs在食管癌DDP耐药中的作用机制研究甚少,本研究旨在通过筛选人食管鳞癌耐药细胞株TE-1/DDP与DDP耐药相关的IncRNA和mRNA,研究其潜在的作用机制。1991年Bartolomei发现了第一个长链非编码RNA为H19。2002年,Okazaki等人首次明确地定义lncRNAs为长度大于200个核苷酸的转录物。人类基因组计划显示,只有不到2%的基因组编码蛋白质,而超过98%的基因组被转录成非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)。更令人意外的是,发现76%的ncRNAs被转录成lncRNAs,其中大多数由RNA聚合酶Ⅱ转录。lncRNAs中没有开放阅读框架(open reading frame,ORF)结构,即使有一个ORF,也不能翻译几个,导致仅少数肽的翻译。大多数lncRNAs具有明显的时间和空间表达特异性,且序列保守性较低。近几年,发现lncRNAs在表观遗传调控、转录以及转录后调控中发挥核心作用;lncRNAs在疾病的发生中也具有结构和功能的作用,尤其是在肿瘤的发生中。因此,更好地了解lncRNA的表达变化可能为肿瘤的诊断提供重要线索。lncRNAs可以分为以下几类:①启动子相关转录物:来自启动子区域的转录物;②sense:lncRNAs和mRNAs存在于同一条链上,具有重叠的外显子;③antisense:在相反链上存在于同一链上的lncRNAs和mRNAs,至少有一个外显子重叠;④bidirectional:lncRNA及其相邻基因的转录起始位点位于反义链上;⑤intronic:IncRNAs来源于第二种转录本的内含子,如前体mRNA;⑥intergenic:lncRNAs来源于两个基因序列之间的基因组间隔;⑦3’ UTR相关转录本:lncRNAs来源于3’ UTR区域。与mRNAs类似,lncRNAs也可以存在于细胞核或细胞质中,但主要位于细胞核尤其是染色质中。与mRNAs和蛋白质相比,由于lncRNAs的复杂性和多样性,其功能不能简单地根据它们的结构或序列来描述,但lncRNAs的一个重要作用是调控相邻蛋白质编码基因的表达。此外,潜在的分子机制包括组蛋白修饰、DNA甲基化、剪接调控和蛋白泛素化。二代测序技术(next generation sequencing,NGS)通过提供检测体细胞癌基因组变化的综合方法,彻底改变了肿瘤基因组学的研究,提高了我们对肿瘤生物学的认识和理解。进行研究对象全基因组序列的重新测序,再与参考序列进行比对,可以发现个体差异的分子基础,以寻找疾病的候选基因。本研究中,从食管鳞癌细胞株TE-1构建食管鳞癌顺铂耐药细胞株TE-1/DDP,并对TE-1细胞和TE-1/DDP细胞的IncRNA和mRNA进行二代测序分析,寻找到TE-1/DDP顺铂耐药相关的mRNA为核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2),相关的 IncRNA 为 lncCOPZ2-1,lncCOPZ2-1 位于 17 号染色体。Nrf2 是属于cap’n’亮氨酸拉链(b-ZIP)蛋白家族,作为转录因子的Nrf2可以促进细胞生长,并且研究发现Nrf2及其转录靶基因在肿瘤发生中的潜在作用,并且跟食管鳞癌的放化疗效果在一定程度上存在负相关。目前,有少数关于肿瘤中IncRNAs和Nrf2的互作关系的献报道。在吸烟相关肺癌的细胞系中,发现了位于 5 号染色体上名为 SCAL1(smoke and cancer-associated lncRNA-1)的 lncRNA,其转录调控受到Nrf2的制约;在胆囊癌中lncRNA NmrA-like家族结构域包含一个假基因(Loc344887),Loc344887的表达上调与Nrf2高表达密切相关,Loc344887高表达对上皮细胞间质化有促进作用,因此亦有可能成为胆囊癌治疗的靶点。因此,我们构建Nrf2过表达食管鳞癌细胞株,观察顺铂压力下Nrf2过表达对食管鳞癌细胞生物活性的影响。检测沉默和过表达lncCOPZ2-1对Nrf2表达水平的影响,并通过裸鼠荷瘤实验检测lncCOPZ2-1过表达在活体内对食管鳞癌细胞顺铂耐药性的影响。这样,通过体内外实验了解lncCOPZ2-1调节Nrf2参与食管鳞癌顺铂化疗耐药的机制,为逆转食管鳞癌顺铂耐药药物的研发提供依据。研究目的研究人食管鳞癌TE-1细胞株和TE-1/DDP细胞株差异性表达的mRNA和lncRNA,发现Nrf2和lncCOPZ2-1上调与TE-1/DDP细胞株顺铂耐药密切相关。进一步研究Nrf2表达水平导致TE-1/DDP顺铂耐药的生物学机制;研究lncCOPZ2-1表达水平对Nrf2基因表达水平及下游信号通路蛋白的影响;研究过表达lncCOPZ2-1在体外实验观察TE-1/DDP细胞顺铂耐药性。探索lncCOPZ2-1介导Nrf2导致TE-1/DDP细胞株顺铂耐药的机制,为药物研发提供理论基础和实验依据。研究方法本研究所使用的研究方法包括:人食管鳞癌TE-1细胞株和TE-1/DDP细胞株、二代测序、CCK8实验、Transwell侵袭实验、细胞内活性氧检测、流式细胞术、克隆形成实验、基因转染与敲除、荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、免疫组织化学技术、裸鼠成瘤实验等。主要研究内容1.对人食管鳞癌TE-1和TE-1/DDP细胞株lncRNA和mRNA进行二代测序分析,筛选出与TE-1/DDP细胞株顺铂耐药密切相关的mRNA为Nrf2、lncRNA为 lncCOPZ2-1。2.研究过表达Nrf2基因对人食管鳞癌TE-1细胞生物学活性的影响,及食管鳞癌组织中Nrf2蛋白表达水平与患者预后的关系。3.通过体内外实验研究lncCOPZ2-1是否可以介导Nrf2导致TE-1/DDP细胞株顺铂耐药。本研究主要研究结果:1.对TE-1细胞和TE-1/DDP细胞的lncRNA和mRNA进行二代测序分析,发现Nrf2基因在人食管鳞癌耐药TE-1/DDP细胞株中高表达。2.与Nrf2基因相关的前10位高表达的lncRNA中,lncCOPZ2-1在人食管鳞癌耐药细胞株TE-1/DDP细胞中也高表达。Nrf2的高表达与食管鳞癌患者的预后不良有关。Nrf2高表达能促进TE-1/DDP细胞的细胞活力、增殖能力、克细胞隆形成能力,同时可以抑制TE-1/DDP细胞凋亡和ROS水平。3.lnc COPZ2-1过表达可以促进TE-1/DDP细胞中Nrf2在mRNA和蛋白水平的表达。4.lnc COPZ2-1过表达可以促进TE-1/DDP细胞中Nrf2-ARE抗氧化通路相关基因(HO-1、NQO1、XCT)基因的表达,激活Nrf2-ARE抗氧化通路。Nrf2过表达抑制cCASP3和Bax的表达,促进Bcl2的表达,即Nrf2过表达抑制食管癌细胞的凋亡。5.在体内实验中,过表达lncCOPZ2-1能够显著地提升TE-1/DDP细胞对顺铂化疗耐药性。本研究主要结论和科学意义:1.本研究发现lncCOPZ2-1和Nrf2与TE-1/DDP细胞株顺铂耐药性有相关性,其潜在的互相作用关系值得进一步研究。2.本研究发现在顺铂压力下,Nrf2高表达可以促进TE-1细胞活力、抑制细胞凋亡、促进细胞克隆形成能力。3.通过体内和体外实验发现Inc COPZ2-1可以正向调节Nrt2,导致TE-1/DDP细胞株对顺铂化疗耐药,为药物研发提供理论基础和实验依据。本研究的创新之处:1.本研究的创新性在于,发现了过表达的IncCOPZ2-1上调Nrf2的表达水平,与食管鳞癌对DDP化疗产生耐药性相关,部分解释了食管鳞癌DDP耐药的分子生物学原因。2.本研究预测IncCOPZ2-1可以作为DDP耐药的筛选指标,同时为扭转DDP耐药研究提供切入点。本研究的不足之处:1.本研究中只发现IncCOPZ2-1与Nrf2的线性调节关系,但是IncCOPZ2-1作用于Nrf2的具体分子生物学机制需进一步实验研究和探索。2.食管鳞癌DDP耐药有多因素、多基因参与,仍需要大量实验研究深入了解DDP耐药的网络调节机制。进一步研究计划:1.进一步通过IncRNA所具有的分子生物学功能,设计实验方法,从分子学水平研究Inc COPZ2-1作用于Nrf2的分子生物学机制和潜在信号通路。2.进一步补充实验的样本量,筛选出与食管鳞癌顺铂耐药密切相关的IncRNA和mRNA,由点及面的研究两者相互作用的网络调节机制。