柑橘（Citrus）是热带和亚热带最主要的常绿经济果树,受多种害虫危害,其中蚧虫是一类很难防治的害虫,造成了很大的经济损失。以往对柑橘蚧虫的防治主要采用化学防治,关于柑橘抗虫性基因的研究,特别是利用外源MeJA诱导抗性基因的研究很少有人报道。本研究以盆栽柑橘（Citrus reticulata Banco）作为实验材料,通过提取高质量的柑橘叶片总RNA,RT-PCR扩增柑橘看家基因β-actin和茉莉酸信号转导途径中起关键作用的COI1同源基因与叶绿体ATPase基因片段。采用半定量RT-PCR的方法,研究蚧虫危害和茉莉酸甲酯处理与柑橘叶绿体ATPase基因的表达相关性。这对于了解MeJA在柑橘中的诱导抗逆性作用机理,建立一套利用外源的JA和MeJA的诱导效应,调控柑橘对蚧虫的抗性,进行生物防治是非常重要的。具体研究内容和结果如下:1.柑橘叶片总RNA的提取方法研究采用Trizol法,比较了天根公司的RNAplant Reagent试剂和TaKaRa公司的RNAisoReagent试剂的两种提取柑橘总RNA的方法。结果发现,采用TaKaRa公司的RNAisoReagent提取柑橘叶片的RNA,电泳显示28S和18S的条带比较清晰,说明提取的总RNA质量较好且无明显降解。其A₂₆₀/A₂₈₀为1.820,介于1.7～2.0,A₂₆₀/A₂₃₀为2.088,大于2.0,RNA得率为2.840μgμL^-1。使用天根公司的RNAplant Reagent提取的RNA,电泳显示28S和18S的条带的带型较模糊,并含高分子带,即有DNA污染,DNA消化后质量仍然不高。A₂₆₀/A₂₈₀为1.464,A₂₆₀/A₂₃₀为1.603,不能满足后续实验的要求。因此,本研究确定采用TaKaRa公司的RNAiso Reagent试剂提取柑橘叶片的总RNA。2.柑橘β-actin看家基因扩增研究柑橘叶片总RNA反转录合成cDNA,以其为模板,用柑橘β-actin引物进行PCR反应,得到的PCR产物条带清晰,引物二聚体较少,片段长度均略小于250 bp,符合预期片段228 bp。柑橘看家基因β-actin的成功扩增证明此基因可以作为内参,为进一步进行蚧虫和茉莉酸甲酯诱导柑橘抗性基因表达和相关基因克隆研究提供了基础。3.柑橘COI1同源基因基因片段的扩增以cDNA作模板,通过对PCR各种条件的摸索试验,用F1和F3与F2和F3两对引物扩增柑橘COI1同源基因片段,结果用引物F1和F3扩增出200bp左右的条带,但是与预测的片段长度相差甚远,所以很可能是非特异的条带。以cDNA作模板,用引物S1和S5、S2和S5、S2和S3做PCR。通过Mg²⁺、Taq酶的浓度梯度试验和降落PCR试验,结果用引物S2和S3做PCR得到长度处于250-500bp之间的片段,与预期的COI1目的基因片段大小200bp相近,所以对此扩增产物切胶回收,克隆测序。4.PCR产物的序列分析将测序结果在GeneBank数据库中进行BLAST分析,结果是,测序序列的反向互补序列与一些植物叶绿体F-ATPase合酶CF（1）_γ链相应区段高度同源。系统发育分析结果表明,柑橘和北美云杉均为木本植物所以亲缘关系较近,烟草和菜椒均属于茄科所以亲缘关系也很近,其它植物亲缘关系相差较远。同源性比较表明,该克隆基因片段的反向互补序列与北美云杉、烟草、拟南芥、菜椒和菠菜叶绿体ATPase基因的核苷酸序列同源性分别为78.3%、77.1%、70.9%、74.3%和67.7%。因此,确定此基因片段为柑橘叶绿体ATPase基因片段。5.采用半定量RT-PCR的方法,检测柑橘受褐软蚧危害和茉莉酸甲酯诱导后,叶片中叶绿体ATPase基因的表达半定量RT-PCR检测结果表明,褐软蚧危害后柑橘叶片内叶绿体ATPase基因mRNA的表达量与对照相比较大,但是有的重复变化不十分明显;茉莉酸甲酯处理以后柑橘叶片内叶绿体ATPase基因mRNA的表达量与对照比较也相对较高,但是有时处理和对照样本的差异不明显,说明在重复之间有不稳定的现象。这可能是试验误差引起的,有待继续研究验证。