木质纤维素(lignocellulose)作为自然界中分布最广、数量最多的可再生资源,其转化为生物燃料的关键步骤是利用相关的酶将纤维素(cellulose)和半纤维素(hemicellulose)最大程度地糖化成为可发酵糖。目前,大多数市售的商品纤维素酶制剂中的半纤维素酶活性很低,不足以转化木质纤维素材料中的半纤维素成分。而木质纤维素原料中未被降解的半纤维素会阻碍纤维素酶对纤维素的降解。因此,在纤维素酶中添加半纤维素酶很有可能大大提高纤维素材料转化为可发酵糖的效率。长期以来,丝状真菌是工业纤维素酶的主要生产菌株。然而丝状真菌中重要纤维素降解酶不能有效表达一直是制约对其结构和功能深入研究的瓶颈,(如纤维二糖水解酶CBHI)。传统的细菌和酵母表达系统在表达丝状真菌来源的蛋白时有着自身的缺陷,而丝状真菌具有很高的蛋白分泌能力和高效的蛋白折叠分泌体系,其具有成为理想的表达宿主的潜力,尤其在表达真核生物来源的蛋白时具有不可替代的优势。因此,丝状真菌应该会是真菌来源的木质纤维素降解酶的理想的表达宿主。RNA干扰(RNAi)技术可以高效特异地使特定基因沉默,目前该技术已被广泛用于基因功能探索和基因改造等方面。在丝状真菌中,存在多核和易发生非同源重组的现象,传统的基因敲除手段并不能很好地发挥作用,更为重要的是一些与调控相关的功能基因可能同时介导着菌体的生长,对这些基因进行研究时,使用基因敲除手段往往导致菌体致死而不能获得该基因的缺失株,因此RNAi技术对于研究丝状真菌功能基因有着重要的意义。围绕着上述两方面的研究目的,本论文的主要研究内容如下：一、十种半纤维素酶在草酸青霉A15A中的过表达及过表达菌株糖化能力研究利用淀粉诱导条件下胞外蛋白分泌较低的草酸青霉A15A为蛋白表达宿主,用启动子P15A高效过表达了草酸青霉114-2中不分泌或分泌量较低的十种半纤维素酶。SDS-PAGE显示,这十种半纤维素酶在A15中均分别得到大量表达。然后以木糖渣和碱处理玉米秸秆为底物,用糖化实验评价半纤维素酶过表达菌株所产生的重组纤维素酶系的糖化能力。糖化结果显示,除Aga27A外,其余9种半纤维素酶均能不同程度促进原纤维素酶系降解木糖渣或碱处理玉米秸秆的能力。其中Xyn10B, Xyn30A, Abf43C, AxelA, FaelA, Man5A对于木糖渣底物的降解的促进作用较明显；而Xyn10B, Xyn10C, Xyn30A, Xy13A, AxelA, FaelA对于碱处理玉米秸秆为底物时的降解作用的促进较明显。二、半纤维素酶在草酸青霉AlIA本源表达纯化,酶学性质及应用研究为了进一步研究筛选得到的7种半纤维素酶的性质和应用潜能,我们利用草酸青霉A11△表达宿主本源表达并纯化了这7种半纤维素酶,SDS-PAGE显示纯化后的半纤维素酶达到了较高纯度(电泳纯),且蛋白浓度很高。在酶学性质实验中我们分析了7种半纤维素酶的底物谱,并找到了其中4种酶的最适底物,确定了其中三个为木聚糖酶,一个为阿魏酸酯酶。通过分析温度和pH对这4种半纤维素酶的活力影响,发现其中Xyn10B最适温度为40℃,Xyn10C和Xyn30A的最适温度均为60℃；Xyn3OA最适反应pH为5,Xyn10B和Xyn10C的最适pH均为6；研究同时发现三种木聚糖中,Xyn10B的热稳定性较差。而阿魏酸酯酶FaelA最适反应温度为40℃,最适pH为7,其热稳定性测定结果显示Fae1A有较好的热稳定性。为了分析这7种半纤维素酶对降解纤维素材料的作用,我们分别测定了蛋白添加对赛诺纤维素酶和里氏木霉QM9414的发酵液糖化木糖渣和碱处理玉米秸秆能力的影响,发现添加Xyn10B, Xyn30A, Abf43C, AxelA和FaelA均能促进赛诺纤维素酶转化木糖渣,其中AxelA和FaelA的促进效果较显著；而添加Xyn10B, Xyn10C, Xyn30A和AxelA能促进赛诺纤维素酶转化碱处理玉米秸秆。在里氏木霉QM9414的纤维素酶系中添加Xyn10B, Xyn10C和Xyn30A能促进其转化木糖渣的效率；而添加AxelA, Xyn10B, Xyn10C和Xyn30A促进其转化碱处理玉米秸秆效果较明显。实验说明木聚糖酶和酯酶能促进纤维素材料的生物转化。三、草酸青霉中RNA干扰载体的构建及单基因和多基因干扰验证以pUC19为骨架质粒,从头构建了RNA干扰载体pHX-RNAi,以草酸青霉114-2中的主要淀粉酶基因amyl5A为报告基因进行打靶,分别用SDS-PAGE和RT-qPCR的方法验证了对靶基因的干扰效果,结果证明干扰菌株Amy15A的表达受到了严重的抑制,而且这种抑制是通过减少该基因mRNA的量实现的,这说明本实验构建的RNA干扰载体是有效的。并且随机挑选的7株转化子的amy15A的基因表达均受到高效抑制,说明干扰载体pHX-RNAi能够高效打靶目的基因。然后,我们将淀粉酶基因amy15A和外切酶基因cel7A-2串联到pHX-RNAi载体上进行了双基因的干扰,通过酶活测定、蛋白电泳和RT-qPCR分析表明,amy15A和ce17A-2的表达量均受到高效抑制,说明pHX-RNAi可以通过一步操作沉默多个基因,这在丝状真菌的基因改造中十分具有应用前景。