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第一部分高氧所致大鼠急性肺损伤Toll样受体2、4的变化目的:探讨Toll样受体(TLRs)在高氧所致急性肺损伤发病过程中的变化及作用。方法:将24只SD大鼠置于氧体积分数大于95%的密闭氧仓中,分别于氧气暴露24、48、72h,8只呼吸正常空气的SD大鼠作为对照组,活杀各组大鼠,取肺组织标本,测定肺湿/干重(W/D)比值以及肺组织形态学改变。用实时定量(real-time)PCR测定肺组织TLR2/TLR4基因的表达;用免疫印迹(Western Blotting)测定肺组织TLR2/TLR4蛋白的表达;用酶联免疫吸附法(ELISA)测定肺组织匀浆中IL-6的蛋白含量。结果:各高氧实验组肺W/D比值较对照组明显增高(P<0.01),随高氧暴露时间的延长,肺组织呈现弥漫性肺泡炎和间质水肿等病理学改变。Real-time PCR结果显示高氧暴露组肺组织TLR2/TLR4基因表达明显高于对照组(P<0.05),并与24h达高峰。Western Blotting结果显示,高氧组TLR2/TLR4蛋白表达较对照组明显增高(P<0.05),峰值分别在48h、72h;ELISA结果显示高氧组肺组织匀浆IL-6蛋白含量较对照组明显增高(P<0.05),48h达高峰。结论:在高氧引起急性肺损伤中,TLR2/TLR4在肺组织的炎症的启动和维持中起重要的作用。第二部分高氧所致氧化应激状态下肺泡上皮细胞Toll样受体2/4表达及其功能研究目的:观察高氧暴露后,肺泡上皮细胞内ROS水平与TLR2/4基因、蛋白表达变化及其信号通路的功能之间关系,探讨高氧所致肺损伤炎症反应的可能机制。方法:体外培养人类肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549,分别在>90%氧体积分数高氧环境中暴露2h、6h、12h、24h及48h后(1)用流式细胞术检测细胞内活性氧含量;(2)用real-time PCR法检测TLR2/4基因表达变化;(3)用流式细胞术检测TLR2/4蛋白在细胞中的分布及其表达改变;(4)用EMSA检测A549在高氧暴露后,细胞内NF-ΚB核转录的变化;(5)用ELISA检测A549在高氧暴露后,上清液中IL-6,IL-8的含量;(6)A549细胞予以ROS清除剂NAC预处理后,高氧暴露6h,再分别测定①用流式细胞术检测细胞内ROS含量;②real-time PCR法检测TLR2/4基因表达变化;③用流式细胞术检测TLR2/4蛋白表达改变;④用EMSA检测细胞内NF-ΚB核转录的变化;⑤用ELISA检测A549在高氧暴露后,上清液中IL-6,IL-8的含量。结果:A549肺泡上皮细胞有TLR2/4的表达,并且以胞内表达为主,随高氧暴露时间的延长,胞内ROS含量呈进行性增高,TLR2/4表达随之进行性增高,细胞内NF-κB核转录水平及细胞上清液中IL-6,IL-8水平也呈进行性增高;在NAC预处理的情况下,高氧刺激后,细胞内ROS水平明显降低,细胞TLR2/4表达也随之降低,NF-κB核转录活性水平及细胞上清液中IL-6,IL-8水平增高不明显,其变化与正常空气A549细胞组无统计学差异,而明显低于高氧暴露对照组。结论:A549细胞在高氧暴露后,细胞内ROS能够激活人肺泡上皮细胞TLR2/4的表达,导致前炎症细胞因子IL-6和IL-8的大量释放。这一过程可能是通过TL2/TLR4—NF-kB—炎症介质这一信号转导通路实现的。第三部分siRNA-TLR2和siRNA-TLR4对高氧所致氧化应激状态下肺泡上皮细胞功能的影响目的:观察siRNA-TLR2和siRNA-TLR4转染的A549细胞高氧暴露后,细胞TLR2/4基因、蛋白表达变化及其下游信号通路的功能,进一步证实细胞内ROS可激活TL2/TLR4—NF-kB—炎症介质这一信号转导通路,导致高氧肺损伤炎症反应的启动。方法:体外培养人类肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549,分别转染siRNA-TLR2和siRNA-TLR4,在>90%氧体积分数高氧环境中暴露6h后(1)用real-time PCR法检测TLR2/4基因抑制效率;(2)用流式细胞术检测TLR2/4蛋白抑制效率;(3)用EMSA检测转染后A549在高氧暴露后,细胞内NF-ΚB核转录的变化;(4)用ELISA检测转染后A549在高氧暴露后,上清液中IL-6,IL-8的含量;结果:siRNA-TLR2和siRNA-TLR4可明显抑制A549肺泡上皮细胞高氧暴露后TLR2/4的表达,并且可以降低高氧暴露后细胞内NF-κB核转录活性水平及细胞上清液中IL-6,IL-8水平,与正常空气A549细胞组比较无统计学差异,而明显低于高氧暴露对照组。结论:高氧暴露下上皮细胞内ROS可激活TLR2/4—NF-ΚB—炎症介质信号通路,导致细胞分泌前炎症细胞因子IL-6,IL-8。