【摘 要】
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本论文首先通过紫外诱变、一系列筛选平板和转酮醇酶活力测定获得了转酮醇酶营养缺陷型菌株E.colitkt-7＃。然后通过PCR克隆E.coliK12tktA，并以pUC19为载体转化E.colitkt-7＃。得
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本论文首先通过紫外诱变、一系列筛选平板和转酮醇酶活力测定获得了转酮醇酶营养缺陷型菌株E.colitkt-7＃。然后通过PCR克隆E.coliK12tktA，并以pUC19为载体转化E.colitkt-7＃。得到的转化子能够在M9+Pro+A+X+aroAA筛选平板上生长，其转酮醇酶活力也比tkt-7＃的转酮醇酶活力高出100倍。通过核酸测序进一步证实克隆得到的DNA片段为tktA(携带自身启动子)。为了使tktA能够在Z.mobilisCP4更好的表达，通过PCR重叠延伸技术构建了Peno-tktA，其中Peno是Z.mobilisCP4体内的强启动子。最后以穿梭质粒pZB1为载体，使tktA(携带自身启动子)和Peno-tktA分别在Z.mobilisCP4体内表达。结果表明在ZmobilisCP4体内Peno-tktA能够更高效地表达，其转酮醇酶活力为tktA(携带自身启动子)表达的100多倍。
测定转酮醇酶活力时只加入了一种底物D-核糖-5-磷酸，而另一底物D-核酮糖-5-磷酸是利用待测酶自身粗酶体系或外加的转酮醇酶缺陷型E.coliBJ502粗酶体系中D-核糖-5-磷酸异构酶和D-核酮糖-5-磷酸差向异构酶将部分D-核糖-5-磷酸转化得到的。另外通过两次核酸测序，发现本论文中采用的tktA模板(来自CGSC赠送的E.coliK12)与“EscherichiacoliK12MG1655section266of400ofthecompletegenome”(gb|AE000376．1|AE000376)相差3个碱基。
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