论文部分内容阅读
有关RNA干扰(RNA interference，RNAi)的研究已受到广泛的关注并获得了2006年的诺贝尔生理学及医学奖。随着科学家对RNA调控的深入研究，发现dsRNA(double-standed RNA，dsRNA)不仅可通过RNAi下调基因的表达，还可以通过靶向启动子上调基冈转录水平，即RNA激活（RNA activation，RNAa）。这类RNA分子与发挥RNAi作用的干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）相对应，被称为激活小RNA(small activating RNA，saRNA)。 saRNA与siRNA的调控方式仍有显著不同，siRNA主要作用方式为转录后调控，通过降解mRNA影响蛋白质的翻译，从而下调基因的表达;而saRNA主要发挥转录水平的调控，在启动子区发挥作用，但目前saRNA的作用机制仍未阐明。因此，在人们将基因沉默或基因激活技术作为治疗手段运用于不同疾病之前，有必要对其分子机制进行透彻的研究。 saRNA主要通过在基因启动子区的特异性结合来激活基因的转录，具有靶点依赖性的特征。我们发现，基于TATA box和CpG岛(CpG island，CGI)对基因调控的影响，dsRNA激活具有四种启动子类型。即:即Ⅱ型，有CGI和TATA box，转录起始位点(transcriptional start site，TsS)位于CGI上;Ⅱ型，有CGI，TSS位于CGI上，无TATA box;Ⅲ型为无CGI(或TSS不在CGI上)，有TATA box;Ⅳ型，无CGI和TATA box。Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型启动子中TATA box和CGI都可能对saRNA激活位点设计起重要作用，因此，研究TATA box和/或CGI位置对saRNA激活规律的影响，选择Ⅰ型启动子最为典型。研究TATA box和CGI以外的因素对saRNA激活规律的影响，则需选择Ⅳ型启动子。 通过以上saRNA的特点分析，本课题在研究saRNA激活机制的时候，选择符合Ⅰ型启动子的SOX2基因，符合Ⅳ型启动子的OCT4和NANOG基因进行研究。Oct4，Sox2和Nanog是重编程的三个核心因子，三个因子之间形成相互激活的自调控循环，因此应用三因子可以相互激活的规律是验证RNA激活的最佳策略之一。首先，我们按saRNA的靶点依赖性特征设计针对激活OCT4，SOX2和NANOG的dsRNA，通过RT-PCR、qRT-PCR和western-blot等检测方法检测dsRNA对基因的激活作用。结果证明:均筛选到针对OCT4、SOX2和NANOG三个基因的激活dsRNA，并且检测到Oct4、Sox2和Nanog三个因子在被saRNA激活后，又进一步发生三个因子之间的相互激活作用，确证了saRNA的激活效应。通过对激活saRNA的分析，发现saRNA的激活存在四条规律:(1)两个或三个saRNA可以同时激活各自靶基因;两个saRNA能以协同增效的方式激活相同的靶基因;(2)Ⅰ型启动子被saRNA激活后比Ⅳ型有更高的激活表达量;(3)靶位点越靠近TSS的saRNA具有更高的激活效应;(4) saRNA靶位点通常位于RNA酶结合位点和TSS之间。 其次为进一步阐明saRNA的激活机制，我们通过CHIP及PCR方法对OCT4，SOX2和NANOG三个基因激活时组蛋白和RNA聚合酶Ⅱ与DNA结合情况进行定性分析，同时对H3组蛋白结合情况进行定量分析。发现有CGI和TATA box的Ⅰ型启动子在saRNA激活后核小体组织结构完全被改变;而Ⅳ型启动子在saRNA激活后部分核小体组织结构发生改变。但都遵循相同的规律:在saRNA靶位点最近的位置导致核小体缺失。因此，我们认为saRNA激活基因的根本机制是由于核小体重定位导致启动子上核小体组织结构改变，进而导致转录激活。我们还进一步发现，核小体重定位只决定基因转录与否，并不影响基因的转录效率，基因的转录效率是由转录调控元件和saRNA靶点位置相互作用的结果。这些调控元件包括TATA box和CGI;对Ⅳ型启动子来说，saRNA的靶位点在增强子和近端启动子同样有利于提高基因被激活转录的效率。 通过上述研究，我们初步阐明了RNAa的机制:dsRNA结合在Ⅰ型启动子TATA box下游的特异序列;或结合在Ⅳ型启动子上转录因子结合准备区如近端启动子或增强子，dsRNA与靶点结合后募集染色质重塑复合体、RNA酶Ⅱ及其它转录因子，进而引发核小体重塑。其结果是在saRNA靶位点附近产生核小体缺失区域(nucleosome depleted region,NDR)和saRNA靶位点上募集RNA聚合酶Ⅱ起始复合物(RNA polymeraseⅡinitiate complex,PIC)。NDR产生可消除阻拦PIC延伸道路上的核小体，使转录激活;如果saRNA靶点位于增强子区时，saRNA附近核小体缺失产生的NDR可使增强子区曝露，同时，saRNA募集蛋白起到反式激活因子的作用增强基因表达。 最后总结saRNA设计规律为:针对不同的基因，利用不同的转录调控元件和saRNA靶点位置的相互作用进行saRNA设计能获得更有效、更理想的RNA激活效应。