黄曲霉毒素(Anatoxins，AF)是黄曲霉菌(Aspergillus flavus)等真菌产生的具有致癌作用真菌毒素，包括AFB<,1>、B<,2>、G<,1>、G<,2>和M<,1>等。黄曲霉毒素G<,1>(Aflatoxin G<,1>，AFG<,1>)在我国胃癌、食管癌高发区居民饮食中的检出率很高，是当地粮食主要的污染真菌毒素。 Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar type Ⅱ cell，AT-Ⅱ)是肺泡上皮损伤修复的干细胞。外源性致癌因素如吸烟、粉尘、石英等作用于肺组织可引起AT-Ⅱ损伤、修复和增生，在外源性致癌因素刺激长期反复作用下，AT-Ⅱ细胞可发生癌变而导致肺癌发生。 本研究室前期动物诱癌实验结果表明，AFG<,1>具有致肺癌性，经口给予AFG<,1>可诱发实验小鼠肺腺癌发生。目前有关AFG<,1>诱发肺腺癌研究还局限于长期动物诱癌实验及AFG<,1>诱发不同动物肺癌的验证方面，对AFG<,1>诱发实验动物肺腺癌的组织来源尚缺乏研究，AFG<,1>对实验动物肺组织及AT-Ⅱ的短期影响也未见文献报道。 为进一步探讨AFG<,1>诱癌机制，研究AFG<,1>诱发实验动物肺腺癌的组织学来源细胞类型，探讨AFG<,1>对肺组织和AT-Ⅱ的影响及其可能机制。本研究在前期动物诱癌实验研究的基础上，分析了AFG<,1>诱发肺腺癌组织AT-Ⅱ特异分化标志物SP-C和支气管无纤毛上皮细胞—C1ara细胞特异分化标志物CC-10表达情况；观察了在整体水平和细胞水平上AFG<,1>急性作用对大鼠肺组织和AT-Ⅱ结构和功能的影响及其致损伤生物学效应，同时探讨了JNK信号转导通路在AFG<,1>介导AT-Ⅱ损伤中的作用。 本研究论文共分为五个部分： 1 黄曲霉毒素G<,1>诱发小鼠肺腺癌组织发生的研究 目的：探讨长期经口给予AFG<,1>诱发NIH小鼠肺腺癌的组织学来源以及AFG<,1>长期作用对小鼠肺泡上皮细胞SP-C和PCNA 蛋白表达的影响。 方法：采用本实验室存档的AFG<,1>长期灌胃NIH小鼠58周后存活小鼠肺组织取材石蜡包埋组织块标本24例作为研究对象，其中 AFG<,1>诱发的肺腺癌9例。以同期实验中灌喂生理盐水的12例NIH小鼠正常肺组织作为对照。采用免疫组化方法检测9例肺腺癌组织中SP-C、CC-10、P53和RasP<21>的表达情况。同时，采用免疫组化方法检测不同剂量AFG<,1>长期灌胃组和对照组肺组织肺泡上皮细胞SP-C和PCNA蛋白的表达情况。 2 支气管内给予黄曲霉毒素G<,1>对大鼠肺组织的作用的研究 目的：探讨一次性支气管内给予 AFG<,1>对大鼠肺组织的影响。 方法：按30μg/kg body weight剂量经支气管一次性给予雄性SD大鼠AFG<,1>处理。AFG<,1>处理1、3、7和14d后，分别处死实验动物。部分大鼠支气管插管收集支气管.肺泡灌洗液(BALF)，离心10min收集上清，采用生化法检测乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(AKP)活力。分别切取实验大鼠肺组织进行如下研究工作：取1mm<3>大小的肺组织标本经2.5％戊二醛固定标本24h后，以扫描电镜方法观察大鼠肺组织超微结构变化；取部分肺组织4％多聚甲醛固定4h后，常规石蜡切片制备，采用原位杂交方法检测肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达情况；取部分肺组织10％多聚甲醛固定，常规石蜡切片制备，按S-P 法进行采用免疫组化方法检测核因子-kB(NF-kB)蛋白的表达；取部分肺组织用生理盐水制备成10％的肺匀浆，采用活性氧(ROS)测定法按相应试剂盒操作程序检测肺组中ROS(以H<,2>O<,2>为代表)含量。 3 支气管内给予黄曲霉毒素G<,1>对大鼠肺组织肺泡Ⅱ型上皮细胞影响的研究 目的：探讨一次性支气管给予AFG<,1>对大鼠肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞(AT-Ⅱ)结构和功能的影响 方法：实验动物模型同前一部分。AFG<,1>处理1、3、7和14d后，分别处死实验动物，切取部分新鲜肺组织，分别进行如下研究，取1mm<3>大小的新鲜肺组织固定于4％戊二醛中，待制备透射电镜电镜标本，观察AT-Ⅱ超微结构变化；取部分肺组织10％多聚甲醛固定，常规石蜡切片制备，参照试剂盒说明书按S-P法进行采用免疫组化方法检测SP-C蛋白的表达；部分肺组织固定于70％酒精，采用FCM检测SP-C蛋白的表达；取100mg肺组织加入 500μL 蛋白裂解液，提取肺组织总蛋白，Westem blot方法检测SP-C蛋白的表达；部分肺组织液氮冻存，提取组织RNA，RT-PCR方法检测SP-C和SP-A mRNA的表达情况。 4 黄曲霉毒素G<,1>对体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞影响的研究 目的：进一步探讨AFG<,1>对体外培养的大鼠AT-Ⅱ致损伤作用。 方法：以酶消化法原代分离、培养大鼠 AT-Ⅱ，将10～15mL 细胞悬液接种于0.1 g·L<-1>大鼠IgG处理后的平皿中纯化3h，纯化后AT-Ⅱ用20％DMEM 调整细胞浓度为(1～2)×10<9>L<-1>，接种于96孔板、24孔板和细胞培养瓶中培养24h。用10％DMEM换液后继续培养12h，实验组分别给予不同浓度(0.5，1.0和2.0mg·L<-1>)的 AFG<,1>处理，溶剂对照组和对照组给予DMSO(0.4mL·L<-1>)和生理盐水处理。AFG<,1>作用24h后，收集96孔板细胞采用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞存活率；收集24孔板培养基上清液，采用生物化学方法检测上清液乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(AKP)活力；离心收集细胞于2.5％戊二醛中前固定24h，超薄切片(厚度50nm)，醋酸铀.柠檬酸铅染色，日立H-7500透射电镜观察 AT-Ⅱ超微结构的改变；收集24孔板细胞，Fluo-3/AM负载40min，采用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)检测细胞内[Ca<2+>]；收集24孔板细胞，采用免疫细胞化学、CLSM方法检测AT-Ⅱ SP-C的表达；离心收集细胞于 70％酒精固定，采用FCM方法检测AT-Ⅱ SP-C蛋白表达。 5 JNK 信号转导通路在黄曲霉毒素G<,1>诱导A549细胞损伤中的意义 目的：探讨JNK信号转导通路在AFG<,1>诱导A549细胞损伤中的作用及其机制。 方法： 5.1 AFG<,1>处理24h对A549细胞毒性作用、JNK激酶活性、SP-C 表达及细胞内[Ca<2+>]影响的检测 A549细胞复苏培养后，取对数生长期A549细胞，用10％DMEM调整细胞浓度为(1-2)×10<8>L<-1>，接种于96孔板。实验按AFG<,1>处理8、16、24和48h不同时间分为4个时间点，每个时间点按0.1、0.5、1.0 和2.0mg·L<-1>AFG<,1>依次给予AFG<,1>处理、溶剂对照组和对照组分别给予DMSO(0.4mL·L<-1>)和生理盐水处理。以MTT比色法检测 AT-Ⅱ存活率。 5.2 JNK抑制剂SP600125预处理对AFG<,1>诱导细胞毒性作用、INK 激酶活性和SP-C 表达变化影响的检测 取对数生长期A549细胞用10％DMEM调整细胞浓度N(1～2)×10<8>L<-1>，接种于96孔培养板，随机分为9组：溶剂对照组、对照组、1μM SP600125组、0.5μM SP600125组、0.1μM SP600125组、1μM SP600125+AFG<,1> 1.0mg·L<-1>组、0.5μM SP600125+AFG<,1>1.0 mg·L<-1>组、0.1μM SP600125+AFG<,1>1.0 mg·L<-1>组和AFG<,1>1.0 mg·L<-1>组。细胞培养24h后，更换2％低血清DMEM培养基，溶剂对照组和对照组给予DMSO(0.4mL·L<-1>)和生理盐水处理。 结论： 1.长期经口灌胃NIH小鼠AFG<,1>所诱发的肺腺癌组织来源于AT-Ⅱ，肺腺癌组织中未见突变型P53和Ras P21蛋白表达；AFG<,1>长期经口灌胃NIH小鼠促进肺泡上皮细胞SP-C和PCNA的表达。 2.急性支气管给予AFG<,1>可以增加处理大鼠BALF中LDH和AKP的活力，导致大鼠肺组织超微结构出现损伤性变化；激活肺泡细胞 TNF-αmRNA的表达，降低肺组织抗活性氧能力，但对肺组织NF-kB蛋白的表达没有影响。 3.急性支气管给予AFG<,1>可时间特异性地降低大鼠肺组织SP-C在蛋白水平上的表达，降低SP-C和SP-A在mRNA水平的表达。 4.AFG<,1>对原代培养的大鼠AT-Ⅱ具有明显的致损伤作用，可以增加大鼠AT-Ⅱ细胞内[Ca<2+>]，降低原代培养的大鼠 AT-Ⅱ SP-C蛋白的表达。 5.AFG<,1>作用于A549细胞可以增加A549细胞内[Ca<2+>]、激活JNK蛋白激酶、降低A549细胞SP-C mRNA的表达；给予JNK特异性阻断剂-SP600125预处理可以部分抑制AFG<,1>对A549细胞的细胞毒性作用，但对AFG<,1>诱导SP-C mRNA表达降低没有影响。JNK 信号转导通路可能部分参与介导AFG<,1>致AT-Ⅱ损伤生物学作用。