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【目的】
1.建立糠秕马拉色菌(Mf)感染HMC-1肥大细胞模型。
2.检测Mf感染HMC-1细胞后高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)及其受体(TSLPR)、5个经典炎症小体表达。
【方法】
1.马拉色菌培养：Mf标准株(CBS1878)用改良Leeming-Notman固体琼脂糖培养基(MLNA)培养，用PBS调整浓度至1×109个孢子/ml。
2.细胞培养：HMC-1细胞用含有10%FBS、抗菌混合物的IMDM培养液在37℃、5%CO2条件下培养。
3.最佳感染复数(MOI)筛选：选用4个MOI(5、10、20、30)Mf感染HMC-1细胞0h、3h、6h、12h、24h、48h；采用钙荧光白+DiI荧光双染色，计数内吞孢子阳性细胞。
4.透射电子显微镜观察HMC-1细胞吞噬孢子情况。
5.流式细胞术检测Mf感染后HMC-1细胞凋亡。
6.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹(WB)检测Mf感染HMC-1细胞后HMGB1、TSLP、TSLPR、NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、Pyrin、半胱天冬酶-1(Casp-1)、IL-1β、IL-18表达。
7.ELISA检测Mf感染HMC-1细胞后HMGB1、TSLP、Casp-1、IL-1β和IL-18水平。
8.统计学分析：采用SPSS22.0软件进行方差分析及Kruskal-Wallis检验。
【结果】
1.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞的最佳MOI
4个MOIMf感染肥大细胞3~48h，内吞孢子阳性细胞数在相同时间点不同MOI差异无统计学意义(P＞0.05)，不同时间点相同MOI差异无统计学意义(P＞0.05)。为保证细胞活性，故选用感染复数为5。
2.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞后凋亡
5MOIMf感染HMC-1细胞后各时间点细胞凋亡率与0h比较，差异均无显著性(P＞0.05)，而细胞碎片明显增多。
3.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞后超微结构变化
HMC-1肥大细胞与5MOI的糠秕马拉色菌孢子共培养，不同时间点均可见细胞内含内吞的马拉色菌孢子。细胞外孢子与肥大细胞微绒毛接触，而胞质中内吞孢子周围有透明间隙。
4.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞后HMGB1、TSLP、TSLPR表达
qRT-PCR结果显示：TSLP、TSLPRmRNA表达在不同时间点有不同程度升高，其中TSLPR、TSLP分别在6h、24h最高(P＜0.05)。HMGB1表达量随感染时间增加呈现降低趋势，在48h最低(P＜0.05)。
WB结果表明：TSLP、TSLPR蛋白表达随感染时间逐渐增加，在48h最高(P＜0.05)。HMGB1蛋白表达无明显变化。
ELISA发现Mf感染HMC-1细胞后TSLP、HMGB1分别在12h、24h达最高峰(P＜0.05)。
5.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞后5个经典炎症小体表达
qRT-PCR结果显示：NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、pyrin、Casp-1和IL-18mRNA表达在不同时间点有不同程度升高，其中Casp-1在3h达高峰(P＜0.05)，AIM2和pyrin在感染后6h最高(P＜0.05)，NLRP1在12h表达最高(P＜0.05)，NLRP3、NLRC4和IL-18在48h最高(P＜0.05)。IL-1β在6h表达量最低，6h后表达量增加(P＜0.05)。
WB结果表明：NLRC4、cleaved-IL-1β蛋白表达随感染时间逐渐增加，在24h最高(P＜0.05)。NLRP1蛋白表达随感染时间降低，在48h最低(P＜0.05)。NLRP3、AIM2、pyrin、Casp-1和IL-18蛋白表达无明显变化。
ELISA发现Mf感染HMC-1细胞后Casp-1、IL-1β水平呈上升趋势，在24h最高(P＜0.05)。IL-18水平在3h、24h降低(P<0.05)，但在48h增加(P＜0.05)。
【结论】
1.Mf感染HMC-1细胞的最佳MOI为5。
2.Mf感染促进HMC-1细胞产生TSLP、HMGB1，上调TSLPR表达。
3.Mf感染可能主要激活HMC-1细胞中NLRC4炎症小体，引起IL-1β释放。
4.Mf感染HMC-1细胞不引起明显细胞凋亡。
1.建立糠秕马拉色菌(Mf)感染HMC-1肥大细胞模型。
2.检测Mf感染HMC-1细胞后高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)及其受体(TSLPR)、5个经典炎症小体表达。
【方法】
1.马拉色菌培养：Mf标准株(CBS1878)用改良Leeming-Notman固体琼脂糖培养基(MLNA)培养，用PBS调整浓度至1×109个孢子/ml。
2.细胞培养：HMC-1细胞用含有10%FBS、抗菌混合物的IMDM培养液在37℃、5%CO2条件下培养。
3.最佳感染复数(MOI)筛选：选用4个MOI(5、10、20、30)Mf感染HMC-1细胞0h、3h、6h、12h、24h、48h；采用钙荧光白+DiI荧光双染色，计数内吞孢子阳性细胞。
4.透射电子显微镜观察HMC-1细胞吞噬孢子情况。
5.流式细胞术检测Mf感染后HMC-1细胞凋亡。
6.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹(WB)检测Mf感染HMC-1细胞后HMGB1、TSLP、TSLPR、NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、Pyrin、半胱天冬酶-1(Casp-1)、IL-1β、IL-18表达。
7.ELISA检测Mf感染HMC-1细胞后HMGB1、TSLP、Casp-1、IL-1β和IL-18水平。
8.统计学分析：采用SPSS22.0软件进行方差分析及Kruskal-Wallis检验。
【结果】
1.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞的最佳MOI
4个MOIMf感染肥大细胞3~48h，内吞孢子阳性细胞数在相同时间点不同MOI差异无统计学意义(P＞0.05)，不同时间点相同MOI差异无统计学意义(P＞0.05)。为保证细胞活性，故选用感染复数为5。
2.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞后凋亡
5MOIMf感染HMC-1细胞后各时间点细胞凋亡率与0h比较，差异均无显著性(P＞0.05)，而细胞碎片明显增多。
3.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞后超微结构变化
HMC-1肥大细胞与5MOI的糠秕马拉色菌孢子共培养，不同时间点均可见细胞内含内吞的马拉色菌孢子。细胞外孢子与肥大细胞微绒毛接触，而胞质中内吞孢子周围有透明间隙。
4.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞后HMGB1、TSLP、TSLPR表达
qRT-PCR结果显示：TSLP、TSLPRmRNA表达在不同时间点有不同程度升高，其中TSLPR、TSLP分别在6h、24h最高(P＜0.05)。HMGB1表达量随感染时间增加呈现降低趋势，在48h最低(P＜0.05)。
WB结果表明：TSLP、TSLPR蛋白表达随感染时间逐渐增加，在48h最高(P＜0.05)。HMGB1蛋白表达无明显变化。
ELISA发现Mf感染HMC-1细胞后TSLP、HMGB1分别在12h、24h达最高峰(P＜0.05)。
5.糠秕马拉色菌感染HMC-1细胞后5个经典炎症小体表达
qRT-PCR结果显示：NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、pyrin、Casp-1和IL-18mRNA表达在不同时间点有不同程度升高，其中Casp-1在3h达高峰(P＜0.05)，AIM2和pyrin在感染后6h最高(P＜0.05)，NLRP1在12h表达最高(P＜0.05)，NLRP3、NLRC4和IL-18在48h最高(P＜0.05)。IL-1β在6h表达量最低，6h后表达量增加(P＜0.05)。
WB结果表明：NLRC4、cleaved-IL-1β蛋白表达随感染时间逐渐增加，在24h最高(P＜0.05)。NLRP1蛋白表达随感染时间降低，在48h最低(P＜0.05)。NLRP3、AIM2、pyrin、Casp-1和IL-18蛋白表达无明显变化。
ELISA发现Mf感染HMC-1细胞后Casp-1、IL-1β水平呈上升趋势，在24h最高(P＜0.05)。IL-18水平在3h、24h降低(P<0.05)，但在48h增加(P＜0.05)。
【结论】
1.Mf感染HMC-1细胞的最佳MOI为5。
2.Mf感染促进HMC-1细胞产生TSLP、HMGB1，上调TSLPR表达。
3.Mf感染可能主要激活HMC-1细胞中NLRC4炎症小体，引起IL-1β释放。
4.Mf感染HMC-1细胞不引起明显细胞凋亡。