当前中国不孕不育症的发病率不断上升,导致这类生殖问题的因素众多,但本质上是由于生殖细胞生成异常与受精卵或胚胎发育异常所致。随着IPS诱导技术及体外培养技术的成熟,干细胞移植治疗这类疾病成为一种可能,但目前缺乏理想的大动物模型来评价干细胞移植的治疗效果。本团队前期利用Tet-on 3G可诱导表达慢病毒载体系统通过体细胞核移植的方法成功获得了一批p CW-m Stra8-Tet 3G-Flag-DTA转基因克隆猪。本研究在转基因猪近交繁殖的基础上,对其进行强力霉素（doxycycline,Dox）诱导,作用于m Stra8（mouse stimulated by retinoic acid gene 8）启动子,启动Tet-on系统表达白喉毒素A（diphtheria toxin A,DTA）,检测和评价其生殖细胞的条件性去除效果,以期建立条件性去除生殖细胞的转基因猪模型,该模型对于人类生殖疾病的研究和治疗具有重要意义。本实验前期通过近交繁殖来扩大试验猪种群,当F2、F3代转基因猪出生后,采集猪耳朵组织,PCR进行阳性猪鉴定,并统计F2、F3代阳性仔猪比例。待F2代公猪发育至性成熟时进行为期2个月的强力霉素诱导,然后采集睾丸及心、肝、脾、肺、肾等组织通过RT-PCR检测目的基因DTA的表达。利用q PCR检测各处理组阳性转基因公猪睾丸中DTA基因的相对表达量。通过绝对定量方法检测外源基因在阳性公猪基因组中的拷贝数。Western blot实验检测各处理组公猪睾丸中Flag-DTA蛋白的表达。采用石蜡切片HE染色技术对各处理组公猪睾丸的曲精细管及其中的生殖细胞进行形态学检测与统计。通过免疫组化对各处理组公猪睾丸曲精细管中表达的Flag-DTA蛋白进行定位并对阳性生殖细胞进行统计学分析。利用Tunel切片染色法对睾丸中的各级生精细胞进行凋亡检测与定位。对采集的实验公猪血清进行睾酮激素的测定,并比较各处理组公猪激素水平上的差异。最后,对处于妊娠后期的阳性母猪进行Dox诱导,分阶段采集出生后两周龄、药物诱导后6月龄和11月龄公猪的生殖器官,进行RT-PCR检测,初步探究m Stra8启动子的表达时间。通过以上检测和统计,我们得到F2、F3代出生仔猪阳性率分别为83.3%和75%,说明转基因猪F2代向F3代遗传的过程中,外源基因发生了丢失。F2代公猪各组织RT-PCR检测结果表明,与WT-C（正常公猪）相比,TG-C（未诱导转基因阳性猪）和TG-I（诱导转基因阳性猪）组公猪有且仅有睾丸组织表达了DTA基因。q PCR结果表明TG-C和TG-I组公猪DTA基因的相对表达量无显著性差异。绝对定量求出DTA基因在TG-C、TG-I组公猪基因组中的拷贝数均为104copies/μL。Western blot结果表明,与WT-C相比,TG-C和TG-I组公猪均在睾丸组织中进行了Flag-DTA蛋白的表达。HE染色、免疫组化染色,Tunel切片染色这三种组织形态学检测结果表明TG-C和TG-I组公猪睾丸曲精细管均出现了明显的清空现象且Flag-DTA融合表达蛋白作用时间位于公猪精子发生周期的精原细胞向减数第一次分裂前期发育这一阶段,融合表达蛋白作用后会导致以精母细胞为主的生精细胞异常及细胞凋亡。睾酮激素统计结果表明,与WT-C相比,TG-C组公猪血液中睾酮含量显著下降。m Stra8启动子的表达时间检测结果显示在出生后阳性公猪睾丸中,m Stra8启动子一直启动着DTA基因的表达。综上所述,本研究在m RNA水平、蛋白水平、组织形态学水平证实了药物诱导转基因猪生殖细胞去除是可行的。通过m RNA研究揭示了m Stra8启动子在出生后阳性公猪睾丸中持续启动DTA基因的表达。组织切片统计表明Flag-DTA蛋白作用时间为公猪精子发生周期的精原细胞向减数第一次分裂前期发育这一阶段。融合表达蛋白作用后会导致以精母细胞为主的生精细胞异常及细胞凋亡。