纳他霉素是一类多烯类抗生素,在食品和医疗上被广泛用作抗真菌剂,由于工业菌发酵水平较低,限制其广泛应用。纳他霉素合成过程为典型的I型PKS途径,但其系列合成反应如何高效链接、形态分化与合成途径如何协同等机制至今未有清晰解析,本研究以纳他霉素工业菌株恰塔努加链霉菌L10为研究对象,对其高效生物合成的分子机制进行较为深入的研究,同时为工业菌高产改造提供了理论依据。首先解析了纳他霉素合成途径的后修饰机制。通过对其中5个后修饰酶编码基因进行遗传改造,获得了4,5-脱环氧脱糖纳他霉素、4,5-脱环氧纳他霉素、4,5-脱环氧-12-脱羧基-12-甲基纳他霉素及其脱水化合物等纳他霉素类似物,其中后2个为新化合物。生物指示试验结果显示,其中后3个类似物具有一定的抗真菌活性。scnD的缺失株不产生纳他霉素但积累高产量的4,5-脱环氧纳他霉素,scnK, scnJ和scnC的缺失株均不产生纳他霉素而累积大量的4,5-脱环氧脱糖纳他霉素。scnG的缺失株也不产纳他霉素,而产生4,5-脱环氧-12-脱羧基-12-甲基纳他霉素及其脱水化合物。此外,scnG相连的scnF缺失株中纳他霉素产量降低了53%,同源糖基转移酶基因amphDI和nysDI可以部分回补scnK的功能。研究结果表明,纳他霉素合成过程中ScnGs ScnK和ScnD依次催化羧基化、糖基化和环氧化修饰,后修饰机理的揭示进一步充实了纳他霉素生物合成途径机制。微生物本身的生物经济学原理总是限制每种次级代谢产物的过度合成,特别是野生菌的PKS途径自然设立了许多限速步骤。因此揭示合成途径限速步反应,改造关键合成元件的适配性,是建立高速生物合成途径的关键。本研究成功建立了链霉菌梯度诱导表达体系,用于鉴定纳他霉素合成途径中潜在的限速步骤。以诱导型启动子OROlac和强启动子ermEp’为基础,在没有诱导剂的条件下,OROlac的表达受到LacI蛋白的阻遏;当加入诱导剂IPTG时,LacI对OROlac阻遏得到解除。利用这一模型,首先在链霉菌L10中导入抑制型的egfp质粒,进行诱导表达,Western blotting和qRT-PCR数据显示其表达量随着IPTG的升高逐渐升高直至最大值,且在相对较宽的诱导浓度范围内保持一定的诱导表达量。在此基础上,构建了一系列scnK、scnJ、scnC和scnD的回补菌株,体内稳态动力学分析显示,纳他霉素的产量随着它们的表达量的升高而升高,从而揭示了纳他霉素合成途径中糖基化和环氧化修饰步骤是限速步骤,其对应的催化酶是限速酶,且在我们体内稳态动力学分析范围内这些酶的催化活性并未出现饱和状态和抑制现象。针对上述限速反应节点及其对应的关键酶的稳态动力学曲线,采用链霉菌常用的强表达启动子ermEp*,在L10中分别高表达scnK、scnD、scnJ和scnC基因,纳他霉素的产量均有显著的提高,而且其累积的中间代谢产物大幅降低。组合高表达scnKJC和scnKJCD后,纳他霉素产量进一步提高,两者累积的中间代谢产物均显著下降,获得的高产菌株在YEME中纳他霉素发酵产量提高了147%,在工业培养基中发酵产量提高了232%。50 L发酵罐小试中,以还原糖浓度≈%、溶氧≥30%、pH 6.3作为发酵工艺放大的关键参数,发酵164 h时,最高产量达到15.7 g/L。因此通过增强限速步骤中关键酶基因的表达量,减少中间代谢产物的累积,消除限速步骤,是建立微生物药物高速生物合成通路的关键。微生物药物生物合成途径受到调控网路的复杂调控,其中菌体生长量往往和次级代谢产量关联耦合,而sigma因子在转录水平上对链霉菌形态分化和次级代谢过程起协同调控作用,但该机制未有针对性的阐析。本研究选择L10中第三类sigma因子WhiGch,对其多效调控机制进行研究。whiGch的缺失株生长变慢导致纳他霉素的产生延迟24 h,并且纳他霉素产量比出发菌下降了30%,whiGch高表达菌在工业培养基中产量比出发菌提高了26%;WhiGch正调控纳他霉素生物合成途径,同时抑制migrastatin和jadomycin类似物生物合成基因簇基因表达。凝胶阻滞实验表明WhiGch可直接结合到纳他霉素基因簇的scnC和scnD基因启动子区域,并通过Footprinting实验得知它们的结合序列。利用sigma因子对链霉菌形态分化和次级代谢生物合成途径的协同调控作用,通过遗传改造转录调控因子可提高链霉菌次级代谢生物合成途径的合成效率。