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蓝舌病（Bluetongue,BT）是一种由蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）引起的,经媒介昆虫传播的,可引起反刍动物感染的出血性疾病。BT被世界动物卫生组织列为法定通报类动物疫病,在中国被列为一类动物传染病。世界范围内目前已知的血清型有27种,中国的优势血清型为BTV-1和BTV-16。BT会对动物贸易和生产带来严重的负面影响。目前尚无有效治疗BT的手段,对BT的防控主要依靠疫苗免疫。目前世界上虽然拥有可用的商品化疫苗,但这些疫苗无法区分感染动物和免疫动物（Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA）。为了监测和消灭BT的流行,开展DIVA疫苗的研发十分必要。在本研究中,完全基于质粒的反向遗传系统（Reverse genetic system,RGS）被用于拯救VP2蛋白中含有人的流感血凝素（Influenza hemagglutinin,HA）标签的重组BTV-16,然后在小鼠和绵羊上评价了重组标签BTV-16制备DIVA灭活标记疫苗的免疫效果,为研制新型疫苗奠定基础。具体研究内容和结果如下:（1）建立了一种完全基于质粒的RGS,利用脂质体将重组质粒转染到细胞中,拯救出了含有沉默突变的拯救病毒rBTV-16。利用免疫荧光染色、透射电子显微观察、双链RNA（Doublestrand RNA,dsRNA）基因组电泳、RT-PCR和生长动力学试验对亲本病毒（wtBTV-16）与rBTV-16进行了一系列生物学特性的比较。结果表明:二者在VP2蛋白的表达,病毒粒子的形态学,病毒dsRNA基因组的迁移率和病毒的生长动力学等方面无明显差异。证明了全质粒RGS的实用性。（2）在BTV-16的VP2蛋白中引入HA标签,应用全质粒RGS拯救VP2蛋白中含有HA标签的重组标签BTV-16,再比较重组标签BTV-16与wtBTV-16的生物学特性。根据已知的VP2蛋白模型,通过比对氨基酸序列的差异和相对位置,在BTV-16的VP2蛋白上选择了 9个位点引入HA标签,最终利用RGS拯救了 4株分别在VP2蛋白的N’端、218/219、292/293和420/421位氨基酸位点引入HA标签的重组标签BTV-16。利用与（1）中相似的方法比较了重组标签BTV-16与wtBTV-16的生物学特性。结果表明:重组标签BTV-16在病毒粒子形态学和病毒基因组迁移率方面与wtBTV-16没有明显差别;重组标签BTV-16的VP2蛋白和HA标签蛋白可以正常表达,且二者共定位在BHK-21细胞的细胞质内;重组标签BTV-16的平均滴度低于wtBTV-16,HA标签的引入会对BTV-16的复制能力造成影响。（3）使用 BTV-16 感染干扰素 α/β 受体缺失（Gene knockouts of the interferonα/βreceptor,IFNAR（-/-））小鼠并建立BTV-16的攻毒模型。不同剂量的wtBTV-16攻击IFNAR（-/-）小鼠后,使用RT-qPCR,组织切片的HE染色、免疫组化染色以及中和试验检查IFNAR（-/-）小鼠感染BTV-16后的各项特征。结果表明:BTV-16可以在INFAR（-/-）小鼠体内复制并引起病毒血症和靶器官的组织病理学变化,并能诱导机体产生针对BTV-16的中和抗体。（4）利用IFNAR（-/-）小鼠模型对制备灭活标记疫苗候选株的重组标签病毒rBTV-16-N、rBTV-16-218和rBTV-16-420的免疫效果进行评价。将这3株重组标签BTV-16灭活后配合佐剂免疫IFNAR（-/-）小鼠,使用中和试验,间接ELISA以及（3）中的实验方法评价这些灭活疫苗在IFNAR（-/-）小鼠体内的免疫效果。结果显示:将重组标签BTV-16制成灭活疫苗后按免疫程序免疫小鼠,可在免疫后小鼠的血清中检测到BTV-16的中和抗体以及用于DIVA的抗HA标签抗体,经过免疫的IFNAR（-/-）小鼠被完全保护免于BTV-16的感染。（5）利用绵羊对制备灭活疫苗候选株的rBTV-16-N和rBTV-16-218的免疫效果进行评价。将重组标签BTV-16灭活后免疫绵羊,使用竞争ELISA、中和试验以及间接ELISA检测免疫后绵羊血清中的抗体反应。结果显示:灭活标记疫苗按照免疫程序免疫绵羊后,可检测到绵羊血清中的抗VP7抗体、中和抗体和抗HA标签抗体。综上所述,本研究建立了全质粒RGS,利用该RGS拯救出VP2蛋白中含有HA标签的重组标签BTV-16;本研究建立了 BTV-16（BN96/16）株在IFNAR（-/-）小鼠上的攻毒免疫模型,并利用该模型评价了重组标签BTV-16制备灭活标记疫苗具有DIVA的潜力;使用重组标签BTV-16制备灭活标记疫苗免疫绵羊后,检测了绵羊体内的抗体反应。这些研究结果为重组标签BTV-16制备灭活标记疫苗在DIVA方面的可行性进行了初步探索,进一步为BTV的综合防控奠定基础。