宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,其病死率在所有妇女癌症病死率中占第二位。近年来宫颈癌发生率逐渐增多,且发病年龄越来越年轻化。宫颈癌的诊断方法与步骤已经基本完善,但宫颈癌的治疗还在不断改进之中。宫颈癌的治疗目前一直维持在一个手术、化疗、放疗综合治疗的局面,治疗效果没有显著改善。特别是晚期宫颈癌患者,治疗效果不理想,生活质量低,而且近年来又出现放疗抵抗,化疗耐药等使得宫颈癌的治疗处于瓶颈阶段。如何治疗宫颈癌,有效的改善疗效,提高患者的治愈率及生活质量已经成为宫颈癌研究中最关键的问题之一。随着科学技术的发展,近年来多种肿瘤的治疗已经进入到分子治疗水平,少数针对有效靶基因的治疗已经被运用到部分肿瘤的临床研究中,而宫颈癌的基因治疗却一直停滞于基础研究阶段。肿瘤的发生发展是一个由多种基因共同作用的复杂过程,而微环境的改变使得各种基因表现出不同作用从而使得这个过程更加复杂。找到有效的基因,研究其在微环境中的变化,从而探讨该基因对于肿瘤的作用是我们需要研究的第一步。是否能对该基因进行有效干扰是该基因能否运用于临床治疗的前提。本研究希望能从肿瘤所存在的微环境出发,找到一个有效的靶基因,并能对该靶基因进行有效干扰,最终希望能通过对该基因进行干扰使宫颈癌的生物学行为发生改变,从而为临床中宫颈癌治疗或提高宫颈癌治疗的疗效提供依据。宫颈癌是人体内的一种实体肿瘤。研究发现在宫颈癌患者中宫颈组织的PO2低于正常宫颈组织,而且随着宫颈癌期别的增加,PO2的水平降低。简而言之,宫颈癌组织中存在缺氧微环境。研究表明缺氧微环境在多种肿瘤的形成与发展过程中发挥重要作用,参与到肿瘤细胞的代谢适应、凋亡抵抗、血管生成和侵袭、转移等各个方面。缺氧微环境对于肿瘤细胞的作用通过缺氧诱导因子家族(HIF)实现。目前已知的缺氧诱导因子包括HIF-1,HIF-2和HIF-3。每个因子都由不同的功能亚基和相同的结构亚基组成。HIF-2α是HIF-2的功能亚基,于1997年发现,是近年来发现的最重要的缺氧诱导因子之一目前研究较少,但已引起国内外医学研究者的广泛重视,相关研究正在不断展开。已经有研究证实HIF-2α基因与肺癌,肾癌等关系密切,并且在这些肿瘤中HIF-2α基因所发挥的独特作用是其他缺氧诱导因子所无法替代的。还有研究指出HIF-2α基因表达具有组织特异性,并受周围环境影响。此外,HIF-2α基因还被发现在放疗抵抗,化疗耐药中发挥了重要的作用,从而被认为对于肿瘤的治疗有重要意义。HIF-2α基因在宫颈癌中是否表达,其表达与是否受微环境影响?HIF-2α基因能否被有效干扰?以及HIF-2α基因对宫颈癌的生物学行为是否有影响,微环境是否在这些影响中起作用?HIF-2α基因的靶基因有哪些,微环境是否对它的作用产生影响?这些问题在国内外未见相关研究报道。本研究首先就宫颈癌Hela细胞株中HIF-2α基因的表达情况进行研究,并通过RNAi技术对HIF-2α基因进行干扰,找出最佳干扰靶点,对Hela细胞中的HIF-2α进行有效干扰后了解其相关基因的表达情况,以探讨HIF-2α在宫颈癌Hela细胞中的作用机制。最后将Hela细胞中HIF-2α进行有效干扰后再进行肿瘤相关基因检测和细胞克隆及细胞侵袭实验,以探讨HIF-2α对于Hela细胞生物学行为的影响。通过本实验希望能为临床治疗宫颈癌提供新的思路和方法。第一部缺氧及常氧条件下宫颈癌Hela细胞培养及HIF-2α表达水平的研究目的：本研究通过对常氧及缺氧条件下宫颈癌Hela细胞的增殖情况及HIF-2α的表达情况进行检测。拟探讨与常氧相比,缺氧条件下Hela细胞的生长情况及HIF-2αmRNA的表达水平的改变趋势。方法：检测常氧及缺氧条件下宫颈癌Hela细胞的生长情况,并用MTT方法绘制生长曲线,运用real-time PCR方法检测常氧及缺氧条件下HIF-2αmRNA的表达水平。结果：1.(1).常氧条件下,Hela细胞的OD值从第1天开始明显增高,于第5天到达峰值(p<0.05),而第7天、第9天的OD值略有降低,且第7天与第9天相比,OD值无明显差别(p>0.05)。(2).缺氧条件下,Hela细胞OD值从第1天开始明显增高,于第3天达到峰值,而从第5天开始,细胞的OD值明显降低(p<0.05)2. Hela细胞常氧和缺氧条件下培养24小时后检测HIF-2αmRNA水平,结果示：(1).缺氧条件下的Hela细胞HIF-2αmRNA的表达水平明显增高(p<0.05)；(2).在缺氧条件下培养第3天时HIF-2αmRNA的表达水平达到峰值(p<0.05),第5天时略有下降,但与第3天HIF-2αmRNA表达无明显差别(p>0.05)。结论：1.常氧条件下,Hela细胞的指数生长期是第1-5天,第7天至第9天细胞生长达到平台期。缺氧条件下,Hela细胞的指数生长期是第1-3天,而从第5天开始,细胞OD值明显下降(p<0.05),提示Hela细胞可能不能长时间耐受缺氧状态。2.缺氧环境可以诱导宫颈癌Hela细胞中HIF-2αmRNA表达增强；在缺氧诱导初期(第1-3天)HIF-2αmRNA表达有一定时间依赖性；第3-5天HIF-2αmRNA表达进入平台期。Hela细胞在缺氧诱导后期(第7-9天)大部分死亡,提示HIF-2α可能促进Hela细胞生长,但其不能使Hela细胞长时间的耐受缺氧状态。第二部分宫颈癌Hela细胞HIF-2α基因沉默效率的研究目的：本研究通过对以HIF-2αmRNA为靶序列的4组siRNA干扰序列进行筛选,以构建最有效的抑制HIF-2α基因表达的慢病毒载体,为后续实验奠定基础。方法：应用RNAi设计软件,设计针对HIF-2αmRNA作用的4条siRNA的序列,并将其分别插入到慢病毒载体中,通过对病毒载体的包装,获得较高滴度的慢病毒后,采用两种不同剂量的慢病毒转染293T细胞,运用RT-PCR和werstern blot方法检测HIF-2a mRNA及蛋白质水平,以了解4条siRNA干扰效果。从而筛选出对HIF-2α基因沉默作用较强的干扰序列及病毒载体剂量。将两种不同剂量的含有最佳干扰序列的慢病毒载体转染宫颈癌Hela细胞后,运用real-time PCR方法检测HIF-2αmRNA表达,验证siRNA对宫颈癌Hela细胞中HIF-2α的沉默效果,并找到最佳病毒载体剂量。结果：1.4条siRNA序列均能干扰HIF-2α基因表达,其中KD2序列对HIF-2α基因的干扰作用最强(p<0.05)。2.两种不同剂量的慢病毒载体比较,高剂量慢病毒载体的干扰效果更明显(p<0.05)。结论：1.4条siRNA序列均有沉默HIF-2α的作用,其中KD2序列的沉默作用最强(p<0.05),提示KD2序列能有效沉默HIF-2α基因。2.高剂量的慢病毒载体对HIF-2α基因的沉默效果更强。第三部分HIF-2a基因沉默对Hela细胞生物学特性影响的研究目的：本研究通过对HIF-2a基因沉默前后,在常氧和缺氧条件下Hela细胞生物学特性相关基因(cox-2、VEGF)表达的检测,以及细胞克隆形成率和侵袭力的检测,初步探讨HIF-2α基因的沉默对Hela细胞生物学特性的影响。方法：在常氧和缺氧条件下,根据是否对HIF-2α基因干扰而将Hela细胞分为未转染组(CON组)、阴性转染组(NC组)和转染组(KD组),运用real-time PCR方法检测各组中HIF-2α, cox-2和VEGF的表达水平,运用限度稀释克隆形成法检测Hela细胞克隆形成率,运用肿瘤细胞侵袭试验检测Hela细胞侵袭力的强弱。结果：1.在Hela细胞中,经siRNA沉默后HIF-2基因表达水平在常氧和缺氧环条件下均明显降低(P<0.05),但常氧和缺氧条件下比较HIF-2αmRNA水平无明显差异(P>0.05)。2.(1).常氧和缺氧条件下,cox-2 mRNA在未转染组和阴性转染组中的表达无明显差异；(2).HIF-2α基因未沉默时,常氧与缺氧条件下的cox-2 mRNA表达水平无明显差异(p>0.05)；(3).常氧和缺氧条件下,HIF-2α基因沉默后,cox-2 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)；但常氧与缺氧比较cox-2 mRNA表达水平无明显差异(p>0.05)。3.(1).常氧和缺氧条件下, VEGF mRNA在未转染组和阴性转染组中的表达无明显差异(p>0.05)；(2)HIF-2α未沉默的Hela细胞中,VEGF在缺氧条件下的表达水平明显高于常氧条件下表达(p<0.05)；(3).常氧条件下,HIF-2α基因沉默前后的Hela细胞中VEGF mRNA的表达水平无明显差异(p>0.05)；(4).缺氧条件下,HIF-2α基因沉默后VEGF mRNA的表达水平明显降低(p<0.05)；(5).HIF-2a基因沉默后,在常氧和缺氧条件下VEGF表达水平无明显差异(p>0.05)。4.(1).HIF-2α基因未沉默时,常氧与缺氧条件下的Hela细胞克隆形成率无明显差异；(2)常氧和缺氧条件下,HIF-2α基因沉默后,Hela细胞的克隆形成率明显降低；(3).HIF-2α基因沉默后,与常氧条件相比,缺氧条件下Hela细胞克隆形成率明显减低。5. (1).HIF-2α基因未沉默的Hela细胞中,与常氧相比,缺氧条件下的Hela细胞中侵袭力率明显降低；(2).缺氧和常氧条件下,HIF-2a基因沉默后,Hela细胞侵袭力均明显减低；(3).HIF-2a基因沉默后,与常氧条件相比,缺氧条件下的Hela细胞侵袭力无明显改变。结论：1.Hela细胞中HIF-2α能被有效沉默且不受缺氧因素的影响；2.常氧和缺氧条件下HIF-2α基因沉默均可导致cox-2基因表达下调。3.常氧条件下HIF-2α基因沉默不能导致VEGF基因表达改变；但在缺氧条件下HIF-2α沉默可导致VEGF表达下调；缺氧状态可诱导Hela细胞中的VEGF mRNA表达水平增高。4.HIF-2α基因沉默后,Hela细胞的成瘤性和侵袭力明显下降；缺氧和常氧相比,细胞成瘤性明显降低而侵袭力无明显差异。