目的探讨益气解毒法不同组方对CNE2Z鼻咽癌细胞骨架蛋白系统的干预效应及其对细胞迁徙运动潜能的影响,分析其生物学意义与潜在的临床应用前景。材料、方法与结果第一部分益气解毒法主要组方及其基本药理学特性一、材料与方法依据益气解毒法组合不同益气解毒方(原方及改方),常规制备大鼠药物血浆(原方组与改方组),同时取健康同系大鼠血浆作为正常对照,分别确定各组方对靶细胞鼻咽癌细胞株CNE2Z IC50及其非毒性血浆浓度。二、结果当正常大鼠血浆浓度等于和低于15％时,对细胞增殖活性无明显影响。拟合回归方程算出,原方组药物血浆IC50浓度为8.4％,在排除血浆浓度对细胞毒作用的基础上,改方组所设浓度均对细胞增殖无抑制作用,所用浓度参照原方组配制,与原方组对应。原方组最高无毒浓度为2.50％。实验过程中,各方分别取2.50％和1.25％两个无毒浓度。第二部分益气解毒法不同组方对CNE2Z细胞迁徙运动潜能主要责任基因表达活性的影响一、材料与方法以正常大鼠血浆组作为对照,分别应用益气解毒不同组方药物血浆IC50和两个无毒浓度对CNE2Z细胞进行干预,采用RT-PCR法检测干预前后靶细胞迁徙运动潜能主要责任基因nm23mRNA与c-myc mRNA转录活性,免疫细胞化学SABC法检测靶细胞nm23、c-myc蛋白表达水平,并进行对比分析。二、结果与分析与对照组相比,原方及改方的高中剂量处理组CNE2Z细胞中nm23-H1mRNA表达稍有升高,原方及改方低剂量组无明显变化；改方高剂量组c-myc mRNA表达水平明显高于对照组,其余各组无明显差异。与对照组比较,原方处理组CNE2Z细胞中c-myc蛋白表达水平无显著性差异,但原方促进nm23-H1蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.01)：改方能促进c-myc蛋白的表达和抑制nm23-H1蛋白的表达,差异均有统计学意义(P<0.01)。第三部分益气解毒法不同组方对CNE2Z细胞迁徙运动潜能主要责任骨架蛋白表达活性的影响一、材料与方法以正常大鼠血浆作为对照,应用益气解毒不同组方药物血浆对CNE2Z细胞进行干预,采用免疫细胞化学SABC法检测干预前后靶细胞骨架蛋白β-微管蛋白、F-actin蛋白、p-Ezrin蛋白表达活性,RT-PCR法检测其主要责任基因p-Ezrin mRNA转录水平,并进行对比分析。二、结果与对照组比较,原方能显著抑制β-tubulin. F-actin和p-Ezrin蛋白在CNE2Z细胞中的表达,差异均有统计学意义(P<0.01)；而改方高剂量组能够促进β-tubulin、F-actin和p-Ezrin蛋白在CNE2Z细胞中的表达,差异均有统计学意义(P<0.01)。改方的中、低剂量组对F-actin蛋白表达无明显影响,但可抑制β-tubulin和p-Ezrin蛋白在CNE2Z细胞中的表达,与对照组的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比,改方的高剂量处理组CNE2Z细胞中p-Ezrin mRNA表达明显高于对照组,原方各组及改方中低剂量组mRNA表达水平明显低于对照组。第四部分益气解毒法不同组方对鼻咽癌细胞CNE2Z迁徙运动潜能的影响及其与相关责任基因表达活性的相关性分析一、材料与方法以正常大鼠血浆作为对照,分别应用益气解毒法不同组方药物血浆对CNE2Z细胞进行干预,采用划痕实验法评价药物干预前后靶细胞迁徙运动潜能,然后分别应用电镜和普通光镜观察细胞伪足与细胞形态特征,分析靶细胞迁徙运动特征及其对不同益气解毒方药物血浆的反应特性,探讨其干预机制、生物学意义及潜在的临床意义。二、结果与对照组比较,原方高浓度组显著抑制了细胞迁徙运动,差异有统计学意义(P<0.01),各组与原方高浓度组比较均有统计学意义(P<0.01)。光镜下结果显示：原方组24小时细胞迁徙较对照组及改方组距离短,迁徙能力较差,改方组较对照组及原方组细胞迁徙能力强,迁徙距离远。电镜观察结果显示,原方干预后细胞生长较对照组松散,伪足呈丝状,伸展不如对照组明显,提示原方抑制了CNE2Z细胞伪足的生长。改方干预后,细胞生长与对照组及原方组比较,伪足呈丝状,长度较长,伸展更明显,提示改方能够促进细胞伪足生长。第五部分益气解毒法不同组方影响CNE2Z细胞迁徙运动潜能的细胞信号传导通路干预机制一、材料与方法以正常大鼠血浆作为对照,应用益气解毒不同组方药物血浆对CNE2Z细胞进行干预,采用免疫细胞化学SABC法检测药物干预前后靶细胞迁徙运动信号传导系统主要责任基因p-JNK.Racl表达活性,分析益气解毒方对靶细胞迁徙运动细胞信号传导通路的干预效应,探讨其干预机制、生物学意义及潜在的临床意义。二、结果与分析与对照组比较,原方明显抑制Rac-1在CNE2Z细胞中的表达,差异有统计学意义(P<0.01)；改方高剂量组明显促进Rac-1在CNE2Z细胞中的表达,差异有统计学意义(P<0.01)；改方中、低剂量组则抑制Rac-1在CNE2Z细胞中的表达,差异有统计学意义(P<0.01)。原方显著抑制CNE2Z细胞p-JNK的表达,与对照组的差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.研究结果表明,鼻咽癌细胞CNE2Z迁徙运动潜能相关的生物力学自然机制中,p-Ezrin高表达引起细胞骨架蛋白F-actin的表达及微管蛋白β-tubulin表达增高,并可导致细胞骨架蛋白F-actin的重新分布,微丝的重新分布可促进细胞伪足的形成,表达增高的β-tubulin可激活racl,导致微丝的生长和伪足的形成。此即鼻咽癌细胞CNE2Z迁徙运动潜能相关的正性生物力学机制分子基础。此外,转录因子c-myc的表达与细胞迁移运动密切相关,但其表达同时受到nm23基因和p-JNK的调控,nm23基因还可通过rac/Rho信号途径调控细胞运动。细胞内膜周围微管的生长能激活Racl,导致微丝的生长和伪足的形成。此为CNE2Z细胞迁徙运动潜能相关的调控机制。2.益气解毒原方可通过抑制p-Ezrin的表达,诱导CNE2Z细胞骨架微丝蛋白F-actin及微管蛋白tubulin表达活性降低,抑制细胞伪足的形成。3.益气解毒改方可通过促进p-Ezrin基因的表达,诱导CNE2Z细胞骨架微丝蛋白F-actin及微管蛋白tubulin表达活性增高,并可引起细胞骨架微丝蛋白F-actin的重新分布,而微丝的重新分布可以促进细胞伪足的形成。4.益气解毒原方可增强nm23基因表达活性并抑制P-JNK的表达水平。nm23基因表达活性增强可进一步降低rac/Rho信号传导通路中rac1的表达；而且微丝蛋白表达活性受抑制也影响了rac1的激活。二者的协同作用,使得细胞迁移运动能力减弱。可能通过JNK信号传导通路中p-JNK的表达活性抑制,原方对CNE2Z细胞的迁移运动潜能和增殖活性发挥抑制效应。5.益气解毒改方可以抑制nm23基因的表达活性,失去对rac/Rho信号传导通路的负性调控效应,以致rac1表达活性增强,诱导微丝的生长和伪足的形成,而nm23与c-myc转录因子结合水平的降低以及c-myc转录因子表达活性的增强,均可以促进细胞迁徙运动潜能。6.综合分析相关实验结果,数据显示,益气解毒原方的总体药理作用,是对CNE2Z细胞的迁徙运动潜能发挥抑制效应；相反,益气解毒改方的总体药理作用,则是表现为促进CNE2Z细胞的迁徙运动潜能。结果提示,即使是依据同类法则组合中药复方,组方原理的细微差别、甚至仅仅是剂量水平的差异,都可能对治疗靶标发挥截然不同的药理效应。这样的药理效应特点,对鼻咽癌类恶性肿瘤的治疗实践可能产生重要的影响,应引起临床医师的关注。