【摘 要】
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目的:以醋酸铅诱导海马神经元凋亡为模型,观察铅对IP3R、Ca2+、ASK1-JNK/p38信号通路的影响,探讨对氨基水杨酸钠（PAS-Na）对铅致海马神经元凋亡的干预作用,为应用PAS-Na治疗铅中毒提供科学依据。方法:取出生24小时内的SD大鼠分离出海马,体外培养原代海马神经元,并进行神经元鉴定。体外培养海马神经元经不同浓度的醋酸铅溶液染毒24小时后,经CCK8法测定神经元存活率,Hoechs
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目的:以醋酸铅诱导海马神经元凋亡为模型,观察铅对IP3R、Ca2+、ASK1-JNK/p38信号通路的影响,探讨对氨基水杨酸钠（PAS-Na）对铅致海马神经元凋亡的干预作用,为应用PAS-Na治疗铅中毒提供科学依据。方法:取出生24小时内的SD大鼠分离出海马,体外培养原代海马神经元,并进行神经元鉴定。体外培养海马神经元经不同浓度的醋酸铅溶液染毒24小时后,经CCK8法测定神经元存活率,Hoechst 33342法检测细胞核状态。然后,确定海马神经元的染铅浓度。将生长至第7天成熟的原代海马神经元随机分为正常对照组、染铅组、100μmol/L（μM）、200μM、400μM PAS-Na干预组、PAS-Na对照组。正常对照组、PAS-Na对照组加入正常维持培养基,染铅组、100μM、200μM、400μM PAS-Na干预组加入含有50μM醋酸铅的维持培养基培养24小时。弃原培养液,正常对照组和染铅组加入正常的维持培养基,100μM、200μM、400μM PAS-Na干预组分别加入含有100、200、400μM PAS-Na的维持培养基,PAS-Na对照组加入含有200μM PAS-Na的维持培养基。培育24小时后,采用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒和流式细胞仪检测神经元凋亡率。经荧光定量PCR分析各组神经元IP3R-1、IP3R-2和IP3R-3 m RNA表达量。经Western Blot法测定IP3R蛋白表达水平。为了验证铅是否通过IP3R释放Ca2+,用IP3R的抑制剂2-APB预处理染铅海马神经元。将原代海马神经元随机分为正常对照组、染铅组、Pb+2-APB组和2-APB对照组,正常对照组加入正常的维持培养基,Pb+2-APB组提前加入50μM 2-APB溶液30分钟,接着Pb+2-APB组和染铅组分别加入含有50μM醋酸铅的维持培养基,2-APB对照组加入含有50μM 2-APB的维持培养基培养24小时,采用Fluo-4,AM钙荧光探针试剂盒及EVOS全自动细胞成像系统检测神经元内游离钙离子水平。同时,用同样的方法检测正常对照组、染铅组、100μM、200μM、400μM PAS-Na干预组、PAS-Na对照组海马神经元内Ca2+水平。为了验证铅是否通过Ca2+激活ASK1-JNK/p38凋亡通路,用Ca2+螯合剂BAPTA-AM预处理染铅海马神经元。将原代海马神经元随机分为正常对照组、染铅组、Pb+BAPTA-AM组和BAPTA-AM对照组,正常对照组加入正常的维持培养基,Pb+BAPTA-AM组提前加入20μM BAPTA-AM溶液30分钟,接着Pb+BAPTA-AM组和染铅组同时分别加入含有50μM醋酸铅的维持培养基,BAPTA-AM对照组加入含有20μM BAPTA-AM的维持培养基培养24小时。然后,经Western Blot测定ASK1、p JNK、JNK、pp38和p38蛋白表达水平。用Western Blot法测定正常对照组、染铅组、100μM、200μM、400μM PAS-Na干预组和PAS-Na对照组的ASK1、p JNK、JNK、pp38和p38蛋白表达水平。结果:1.海马神经元染铅24小时后,神经元存活率随着染铅浓度升高而下降,其中30μM、50μM和100μM染铅组与对照组细胞存活率的差异有统计学意义（p0.05）。结论:（1）染铅可导致体外培养大鼠原代海马神经元核碎裂、细胞发生凋亡,神经元存活率降低。（2）铅可能通过IP3R-Ca2+-p38信号通路诱导神经元凋亡。（3）PAS-Na对铅致海马神经元凋亡有一定的干预作用,这可能与其可改善铅致IP3R和Ca2+信号紊乱的作用有关。
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