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研究背景：前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)是花生四烯酸经过环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)催化的代谢产物,通过细胞膜表面的4种G蛋白偶联受体(EP1、EP2、EP3、EP4)发挥作用。研究表明PGE2与肿瘤的关系密切,可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭转移和肿瘤血管的形成。环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)是一种转录增强因子,与cAMP反应元件(cAMP response element, CRE)有高度的亲和力,能增强cAMP诱导的基因转录。CREB通过自身磷酸化发挥转录调节功能,激活一系列下游信号转导通路,在不同类型肿瘤中都表现出促进增值及侵袭转移作用。本实验室前期工作证明,PGE2可以促进胆管细胞癌HuCCT1细胞的生长侵袭,而在胆管细胞癌中,PGE2和CREB之间是否存在调节关系以及在HuCCT1细胞生长侵袭能力调控中的作用机制目前尚未明确。本研究应用PGE2、细胞内钙离子螯合剂、P13K抑制剂等处理人胆管癌HuCCT1细胞,观察其CREB磷酸化水平的变化,意在阐明CREB在PGE2调控HuCCT1细胞生长中的作用及其可能的信号转导通路。研究目的：主要研究PGE2对胆管细胞癌HuCCT1细胞中CREB磷酸化水平的影响及其调节机制。研究方法：1.收集南京医科大学第一附属医院肝内胆管细胞癌组织41例和正常胆管组织20例,免疫组化法检测胆管癌组织和正常胆管组织中磷酸化CREB蛋白的表达情况,并分析磷酸化CREB与肝内胆管细胞癌临床病理特征的关系。2.细胞培养：常规方法培养胆管细胞癌细胞株HuCCT1细胞。3.外源性PGE2处理HuCCT1细胞,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。4.外源性PGE2处理HuCCTl细胞Omin、5min、15min、30min、45min、60min, Western blot实验检测CREB磷酸化水平的变化。5.外源性PGE2处理HuCCTl细胞,激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度变化。6.设对照组、PGE2处理组、PGE2+BAPTA-AM(细胞内Ca2+螯合剂)处理组,Western blot实验检测CREB磷酸化水平和AKT磷酸化水平的变化。7.设对照组、PGE2处理组、PGE2+LY294002(PI3K抑制剂)组,Western blot实验检测CREB磷酸化水平的变化。研究结果1.以20例正常胆管组织为对照组,41例肝内胆管细胞癌组织为实验组,免疫组化实验检测磷酸化CREB的表达情况,结果显示,磷酸化CREB在41例中的阳性表达率为73.2%(30/41),而在正常胆管组织中的阳性表达率为35.0%(7/20),两者差异有统计学意义(P<0.05)。磷酸化CREB蛋白表达在肝内胆管细胞癌病人的性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和神经侵犯等差异上均无统计学意义,在高-中分化肿瘤上的阳性表达率为59.1%(13/22),而在低分化肿瘤上的阳性表达率为89.5%(17/19),两者差异有统计学意义(P<0.05)。2.5μmol/L PGE2处理HuCCT1细胞24h后,Transwell侵袭实验结果显示PGE2处理组小室下层细胞数较对照组小室下层细胞数上升了3.2倍。3.以DMSO为对照,用5μmol/L PGE2处理H:uCCTl细胞5min、15min、30min、45min、60min, Western blot实验发现CREB的磷酸化水平分别上升了64.5%、135.5%、141.9%、98.4%、59.7%,在30min达到最高。4.用5μmol/L PGE2处理HuCCT1细胞至120s,应用激光共聚焦显微镜观察显示HuCCTl细胞内钙离子浓度平均增加约30%。5.以DMSO为对照,实验组分别用5μmol/L PGE2处理30min、5μmol/L细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM预处理30min后再加入5μmol/L PGE2继续处理30min, Western blot实验结果显示PGE2处理组细胞中CREB的磷酸化水平和AKT的磷酸化水平较对照组(DMSO组)分别上升了77.3%和30.4%,而BAPTA-AM+PGE2组细胞中CREB的磷酸化水平和AKT的磷酸化水平较单纯PGE2处理组分别下降了58.9%和26.0%(P<0.05)。6.以DMSO为对照,实验组分别用5μmol/L PGE2和5μmol/LPI3K抑制剂LY294002预处理30min后再加入5μmol/L PGE2继续处理3Omin, Western blot实验结果显示PGE2处理组细胞中CREB的磷酸化水平较对照组上升90.3%,而LY294002+PGE2组细胞中CREB的磷酸化水平较PGE2处理组下降了59.3%(P<0.05)。研究结论：本研究结果表明,PGE2能够上调HuCCT1细胞中CREB的磷酸化水平,从而促进HuCCT1细胞的生长侵袭,此作用可能是通过Ca2+/PI3K/AKT/CREB信号转导通路实现。