目的:口腔黏膜鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤,虽然目前采取了综合序列治疗手段,但仍存在着复发率及转移率高,尤其是晚期鳞癌患者,5年生存率仍然较低,预后较差。化疗是目前口腔鳞癌的主要治疗方法之一,但临床上越来越多的化疗药物耐药性的出现也是制约化疗疗效的最大的瓶颈。一些常用的化疗药物包括顺铂等一个重要的作用机制就是诱导肿瘤细胞内活性氧(Reactive oxigen species,ROS)的形成,同时,哺乳动物细胞内存在的大量的酶或者非酶类的抗氧化剂以对抗氧化剂包括活性氧的存在。一方面,在生理情况下,细胞内的氧化剂和非氧化剂保持着动态的平衡状态,另一方面,在肿瘤治疗过程中,抗氧化剂也可能对抗ROS的作用而减弱甚至抑制化疗药物的作用。谷胱甘肽(GSH)作为最主要的氧化还原调节器,紧密地控制着细胞内的氧化还原平衡,同时也与药物耐药紧密相关。迄今为止,已研究出一些特异性的谷胱甘肽探针,选择性的和定量的检测细胞内谷胱甘肽的变化。然而,就我们所知,目前尚没有任何一种探针被应用于显示通过诱导细胞内氧化还原状态的改变而促进细胞凋亡的过程。这次我们应用了一种新颖的选择性的谷胱甘肽荧光探针来实时检测口腔鳞癌细胞内谷胱甘肽水平的变化,及进一步实时检测在外源性氧化性损害及线粒体内谷胱甘肽清除后引起的氧化性应激及凋亡过程中谷胱甘肽水平的变化。通过本实验进一步了解谷胱甘肽尤其是线粒体内谷胱甘肽水平对细胞氧化性应激及细胞凋亡的影响。方法:1.检测细胞内GSH浓度变化:口腔鳞癌cal-27细胞在100μMH2O2,1mMNAC及5050μM EA连续作用后,用谷胱甘肽探针显示试验前后谷胱甘肽的水平变化,在共聚焦显微镜下蓝色荧光代表着细胞内谷胱甘肽的水平。2.检测治疗前后细胞内GSH及ROS浓度变化:口腔鳞癌cal-27细胞在H2O2及EA作用后,应用GSH探针和DCF-DA探针检测细胞内GSH和ROS的水平变化。在共聚焦显微镜下显示蓝色荧光代表细胞内谷胱甘肽水平,绿色荧光代表细胞内活性氧水平。3.检测治疗前后线粒体内GSH及ROS浓度变化:口腔鳞癌cal-27细胞在H2O2及EA作用后,应用Mitotracker Red CM-H2XRos定位细胞线粒体,GSH探针和DCF-DA探针检测线粒体内GSH和ROS的水平变化。在共聚焦显微镜下显示红色荧光代表细胞线粒体,蓝色荧光代表细胞内GSH浓度,绿色荧光代表ROS浓度。4.检测治疗前后细胞GSH浓度变化和细胞凋亡:口腔鳞癌cal-27细胞在H2O2及EA作用后,应用Annexin V-FITC探针检测细胞凋亡,GSH探针检测细胞内GSH浓度变化。在共聚焦显微镜下显示绿色荧光代表细胞凋亡的发生,蓝色荧光代表细胞内GSH浓度。5.检测线粒体跨膜电位和谷胱甘肽口腔鳞癌cal-27细胞在H2O2及EA作用后,应用JC-1探针检测线粒体跨膜电位,GSH探针检测细胞内GSH浓度变化。在共聚焦显微镜下显示红色荧光代表线粒体跨膜电位的发生,蓝色荧光代表细胞内GSH浓度。结果:1.药物作用前,细胞显示明亮的蓝色,在100μM H2O2作用半个小时后,蓝色荧光减弱,1mM NAC作用1h后,蓝色荧光增强,紧接着在50μM EA作用30min后,蓝色荧光显著减弱几乎消失。2.药物作用前,细胞显示明亮的蓝色荧光和微弱的绿色荧光,在100μM H2O2作用半个小时后,绿色荧光增强同时蓝色荧光减弱,在50μM EA作用30min后,绿色荧光明显增强同时蓝色荧光明显减弱。3.细胞显示红色、蓝色和绿色荧光,红色荧光表示细胞线粒体,红色和蓝色荧光合并后为紫色荧光,这是线粒体GSH。红色和绿色荧光合并后为橙色荧光,这是线粒体ROS。药物作用前,细胞发出明亮的紫色荧光和微弱的橙色荧光。在100μM H2O2作用半个小时后,紫色荧光减弱,橙色荧光增强,在50μM EA作用30min后,橙色荧光明显增强同时紫色荧光明显减弱。4.药物治疗前细胞显示明亮的蓝色荧光和微弱的绿色荧光,蓝色荧光代表细胞内GSH浓度,绿色荧光代表细胞凋亡。在100μM H2O2作用半个小时后,绿色荧光增强同时蓝色荧光减弱,在50μM EA作用30min后,绿色荧光明显增强,蓝色荧光明显减弱。5.药物作用前,细胞显示强烈的蓝色及红色荧光,表示细胞内高浓度的谷胱甘肽及高位的跨膜电位,在100μM H2O2作用半个小时后,蓝色及红色荧光均逐渐减弱,在50μM EA作用30min后,蓝色及红色荧光减低明显,几乎消失。结论:我们的研究显示,这种特异性的谷胱甘肽探针能够被应用来在口腔黏膜鳞癌细胞在H2O2作用及线粒体谷胱甘肽清除作用后发生的氧化性应激及凋亡过程中实时、定量的显示细胞内谷胱甘肽含量的变化。这种谷胱甘肽探针最大的优势在于我们能够实时地和定量地观察到细胞内GSH的变化过程。最后,我们还能得出结论:清除线粒体内的谷胱甘肽能够促进氧化性应激诱导的口腔黏膜鳞癌细胞cal-27的凋亡。