【摘 要】
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禽流感特别是H5N1型禽流感给养禽业造成了巨大的经济损失,已经严重威胁到人类健康。禽流感M1蛋白在病毒复制的过程中发挥重要的调节功能。本实验全面研究了H5N1禽流感的M1基
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禽流感特别是H5N1型禽流感给养禽业造成了巨大的经济损失,已经严重威胁到人类健康。禽流感M1蛋白在病毒复制的过程中发挥重要的调节功能。本实验全面研究了H5N1禽流感的M1基因在大肠杆菌中的表达,并对其表达产物进行了纯化。获得了高效表达的重组M1蛋白,以进一步研究其结构和功能的关系,制备M1的单克隆抗体,也为进一步研究关于H5N1型禽流感的诊断方法奠定基础。根据GenBank中H5N1禽流感的M1成熟肽的cDNA序列,结合表达载体pET-28a的特点设计、合成一对特异性引物。采用PCR的方法扩增M1蛋白cDNA片段,然后将其定向克隆到pET-28a载体中,构建原核表达重组载体pET-28a-M1;用PCR、限制性内切酶酶切以及DNA序列测定等方法进行鉴定。鉴定正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21通过卡那霉素抗性筛选获得稳定表达的阳性工程菌;以1mMIPTG诱导工程菌高效表达重组蛋白pET-28a-M1,利用亲合层析、琼脂糖凝胶层析对重组M1蛋白进行纯化,并用Lowry法测定蛋白含量。结果:1、成功的构建了原核表达载体pET-28a-M1;2、建立了稳定转染原核表达载体pET-28a-M1质粒的BL21细胞株,并证实M1 cDNA在稳定转染细胞株内获得高效可溶性表达;3、高效率地表达并纯化出了重组M1蛋白,蛋白含量为25mg/mL。为进一步解析其三级结构,研究结构和功能的关系,制备单克隆抗体,研发商品化诊断试剂奠定基础。
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