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肠杆菌科细菌为临床常见条件致病菌,且多为肠道正常定植菌。其近年逐渐加剧的耐药问题尤其是产超广谱p-内酰胺酶(ESBLs)菌株的广泛流行使得临床抗感染治疗在抗菌药物选择方面越来越受限制,碳青霉烯类抗菌药物成为治疗这类多重耐药菌株感染的首选和最后一道防线。然而近年来碳青霉烯类抗菌药物耐药菌株的出现尤其是产KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase)型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株的广泛流行,使得碳青霉烯类抗菌药物的抗菌优势逐渐减弱甚至消失。由于这类菌株几乎对所有p-内酰胺类抗菌药物以及多种非β-内酰胺类抗菌药物耐药,其所致感染面临无药可医的困境,严重威胁人类健康。自2007年我院首例产KPC肺炎克雷伯杆菌菌株被报道以来,这类菌株在我院一直呈低水平流行状态。值得庆幸的是大部分菌株仍然对至少一种氨基糖甙类抗菌药物敏感,使得氨基糖甙类抗菌药物在缺少多粘菌素和替加环素的环境下成为对抗这类细菌感染的最后一个有力武器。然而,近一两年,氨基糖甙类抗菌药物抗性在我院产KPC肺炎克雷伯杆菌中不断扩散。这类多重耐药菌株(碳青霉烯类-氨基糖甙类同时耐药)已逐渐超过单纯碳青霉烯类耐药菌株,成为我院主要的产KPC肺炎克雷伯菌株。初步研究发现,这种氨基糖甙类耐药性主要由rmtB16SrRNA甲基化酶基因介导。本研究收集了我院一年间所有碳青霉烯类抗菌药物耐药或敏感性下降肺炎克雷伯菌株,通过PCR和基因测序的方法从中筛选出84株KPC阳性菌株,其中48株携带rmtB16S rRNA甲基化酶基因。对这些菌株通过琼脂稀释法研究其抗菌药物耐药情况、PCR和基因测序查看耐药基因携带情况,脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法分析其克隆相关性,以及选取代表菌株行转化接合试验深入分析携带KPC的质粒情况。同时收集患者各项临床资料,分析此类感染各项临床特点、用药情况及预后,并分开对rmtB阳性组(RPKP)与rmtB阴性组(RNKP)菌株的各项特点进行比较。最后对流行科室(ICU病房)的床边环境、医生办公室、护士站及医护人员的隔离服、手等取样筛查目的菌株定植情况,以探讨院内环境在本院产KPC肺炎克雷伯杆菌流行中的作用。1.产KPC肺炎克雷伯菌株的耐药情况和分子流行病学研究84株产KPC肺炎克雷伯杆菌对p-内酰胺类和喹诺酮类抗菌药物高比例耐药,对多粘菌素和替加环素的敏感比例最高,皆在95%以上。两组中,RPKP组菌株耐药情况更为严峻：除了对所有检测氨基糖甙类抗菌药物高水平耐药外,对四环素类和磷霉素耐药比例也要远远高于RNKP组菌株(米诺环素敏感率:RPKP组6.7%,RNKP组52.8%,P<0.01；磷霉素敏感率:RPKP组8.5%,RNKP组88.9%,P<0.01)。而RNKP组细菌对氨基糖甙类抗菌药物仍有较高的敏感率：阿米卡星,88.9%；奈替米星,72.2%；庆大霉素,47.2%。除KPC外,这些菌株中绝大多数还携带有blaSHV-12, blaTEM-1和blaCTX-M-14基因。除rmtB外,无其他类型16S rRNA甲基化酶基因发现。PFGE分析共发现10个克隆类型：RNKP组可分为7个克隆型,RPKP组分为6个克隆型；MLST分析共发现10个序列型(STs):RNKP组可分为8个STs,RPKP组可分为3个STs。PFGE克隆型A和ST11分别是两组的主要克隆型和序列型。然而,RNKP组PFGE与MLST分型对应关系更为复杂。RPKP代表菌株KP76(ST11,PFGE分型为A型)的质粒分析发现,blaKPC和rmtB,连同blaCTX-M-14, blaTEM-1位于同一个质粒上,这个质粒不能通过接合试验转移。2.产KPC肺炎克雷伯杆菌患者临床资料收集及RPKP、RNKP两组间分析比较共收集64份患者病历资料,其中RNKP组29份,RPKP组35份。两组患者均以男性为主；主要来自ICU病区,其次为外科病区；约半数由当地医院转诊来我院。RNKP组患者菌株分离前平均住院时间为16.2±15.0天,平均总住院时间为45.7±38.4天；RPKP组患者则分别为18.7±15.1天和36.1±22.2天。两组患者中,绝大多数菌株皆为我院获得,仅4例RPKP患者(11.4%)和7例RNKP患者(24.1%)由外院传入。呼吸道分泌物为最常见分离标本,其次为血液和引流液。两组患者总死亡率分别为RPKP组22.9%,RNKP组27.6%,而归因死亡率分别为19.4%和17.9%。但是,两组患者在各个临床特点方面均无显著差异。3.ICU环境筛查产KPC肺炎克雷伯杆菌共收集210份环境标本,其中阳性标本17份,包括一株rmtB阳性菌株。阳性部位包括呼吸机、病床、病历、床头桌、监控器、吸痰器、垃圾桶和拖把。三个患者床位、一个临近患者床位均被污染。值得注意的是,两个曾住过阳性患者的已消毒的空床位皆检出阳性菌株。对所有环境菌株行PFGE分析发现皆属于A克隆型。选取两株代表菌株(一株rmtB阳性,一株rmtB阴性)行MLST分型,发现二者皆属于ST11。以上研究表明：1产KPC肺炎克雷伯杆菌对多种抗菌药物耐药,但对多粘菌素和替加环素仍表现出足够高的敏感率。其中RPKP菌株耐药性更强,对氨基糖甙类、四环素类、磷霉素皆高度耐药,而RNKP菌株对氨基糖甙类和磷霉素仍有较高的敏感率。两组菌株皆以单克隆传播为主(ST11,PFGE A型克隆),但RNKP组菌株表现出更为复杂的基因背景。RPKP流行克隆中,blaKPC和rmtB,连同blaCTX-M-14,blaTEM-1基因位于同一个质粒上。rmtB阳性菌株已逐渐取代rmtB阴性菌株成为我院产KPC肺炎克雷伯杆菌的主要流行菌株。2.两组患者各项临床特点均无显著差异。3.床边环境可能在我院产KPC肺炎克雷伯杆菌的长期流行中起到储存库的作用。已消毒空床位仍有阳性菌株定植,这对我院床边环境消毒措施的可靠性和有效性提出了更高的要求。