受光学系统衍射极限的影响,传统的光学显微镜无法分辨尺寸小于200 nm的生物结构。为了突破光学衍射极限,超分辨显微成像技术应运而生。近年来出现的超分辨成像技术可分为基于受激辐射损耗的显微成像技术、基于频域调制的结构光照明显微成像技术以及基于单分子定位的超分辨显微成像技术等,为研究尺寸在衍射极限之下的生物目标提供了强有力的手段,迅速引起研究者的极大关注。随机光学重构显微成像技术（stochastic optical reconstruction microscopy,STORM）作为单分子定位超分辨成像技术之一,通过调控荧光染料分子的开关态,定位精度可以达到20 nm,可实现超高的空间分辨率。在该成像技术中,除需要可以光致闪烁的新型荧光探针外,图像重构算法在高分辨图像数据的后处理中发挥重要作用。传统的单分子定位超分辨重构算法要求光学探针分子低密度标记目标,避免荧光探针分子的光斑重叠,这需要采集数千帧闪烁图像才能重构一副超分辨图像,图像采集和重构时间均较长,导致超分辨成像时间分辨率低,在活细胞超分辨成像应用中存在困难;针对该问题发展的多分子定位分析算法,可以进行多高斯拟合分析光斑重叠的数据,但当探针标记密度过高,达到多分子定位分析算法的所能处理的标记密度上限时,不仅无法获得理想的重构图像,图像分辨率反而会降低,限制了活细胞动态过程的超分辨成像。为了解决上述问题,研究人员先后开发了多种高密度数据的定位算法,但目前均还未成熟。本论文针对STORM超分辨图像的预处理算法开展了相关研究工作,将一种基于调制图像与虚拟图像的积分值等价关系的预处理算法,即虚拟单像素成像（virtual single pixel imaging,VSPI）算法应用到STORM数据预处理当中,该算法可以将荧光分子标记密度过高、间距过小（100 nm）的重叠光斑数据进行稀疏化预处理,然后结合多分子定位算法进行图像重构,比传统的K因子算法预处理并采用相同重构算法的结果更优。进而,将VSPI算法用于新型STORM荧光探针的闪烁数据预处理,结合现有的超分辨图像重构算法,开展活细胞线粒体超分辨图像重构研究,在保证空间分辨率不变的前提下通过提高标记密度减少图像的采集帧数,从而达到提高成像时间分辨率的目的,为活细胞的超分辨成像研究提供了一种有效工具。本论文的主要工作包括:1.将VSPI预处理算法用于高密度STORM超分辨数据的稀疏化预处理。首先将仿真数据和荧光珠实验数据用VSPI处理,验证其稀疏化处理效果,结果表明其处理效果优于K因子算法;其次,将VSPI算法与多分子定位算法Thunder STORM结合,用于分析仿真实验数据和固定细胞实验数据,并比较VSPI算法对数据进行预处理前后的超分辨重构结果,定量分析不同密度数据重构的超分辨结果的差异,为进一步将VSPI算法应用到活细胞数据处理当中做好准备。2.研究新型STORM荧光探针的光物理性质（包括吸收、发射光谱）、光致闪烁性质（包括饱和激发功率、平均闪烁时间、占空比、抗漂白性等）和细胞特异性标记,然后将其作为活细胞线粒体的STORM探针,采集活细胞STORM超分辨成像数据,为VSPI预处理算法提供活细胞数据支持。3.将VSPI算法用于活细胞实验数据处理,并用于多分子定位算法FALCON超分辨重构,并与未进行预处理的重构结果对比,研究VSPI算法在活细胞STORM超分辨成像中的应用。