目的与背景：肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人类常见的恶性肿瘤之一,在恶性肿瘤发病率排在第五位。由于早期诊断困难和对各种治疗反应差肝细胞癌的5年死亡率仍较高。尽管在肝癌的早期诊断和小肝癌治疗等方面的研究取得了很大的进展,肝癌的治疗手段仍然是有限的。手术切除是常用的根治HCC的方法,但临床确诊的HCC多属中晚期已丧失了手术的机会,HCC术后复发很常见,HCC患者异体肝移植价格昂贵难以推广。HCC对目前常用的化疗药物抵抗,而且肝功能障碍影响化疗药物的代谢和机体的耐受性。射频消融(Radiofrequency ablation therapy)经皮乙醇注射(percutaneous ethanol injection therapy)和动脉化学栓塞法(transarterial chemoembolization, TACE)是目前常用的HCC治疗法,但疗效有限,多属于姑息性治疗。发展新的治疗方法对改善肝癌的治疗极为重要。生物治疗(biotherapy)是肝癌治疗中的第四大类疗法,与手术、化疗和放疗三大常规疗法相互补充,免疫治疗是最常用的生物疗法。免疫治疗通过主动和被动方法增强、诱导机体产生针对肝癌细胞的免疫反应,以杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤的生长,作为常规疗法的辅助手段杀伤常规治疗后残存的肿瘤细胞,具有预防复发与转移的作用。研究表明肝癌细胞表达肿瘤抗原甲胎蛋白(a-fetoprotein, AFP)和黑色素瘤相关抗原(Melanoma-associated antigens, MAGE)等,它们能够被机体的免疫系统所识别,成为细胞毒T淋巴细胞识别的靶分子。目前用于HCC治疗的免疫疗法包括应用各种肿瘤疫苗的主动免疫治疗、应用细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells, CIK)和使用抗体的导向治疗等。HCC免疫治疗亟待解决的问题是HCC的免疫逃逸。肝癌发生发展过程中炎症反应-抗炎反应的失衡是导致HCC免疫逃逸的重要机制。炎症在肿瘤发生发展过程中起重要作用已被广泛接受,几乎所有的肿瘤微环境中都存在着促炎因子,它们通过复杂的网络影响肿瘤的发生和机体对肿瘤的免疫反应,从而影响肿瘤的演进。80%的HCC与B型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和C型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染有关,在中国HCC和HBV感染引起的肝炎和肝硬化常相互伴随。在机体针对感染的肝炎病毒的免疫反应过程中产生大量的促炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α).γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)和白细胞介素-12(Interleukine-12,IL-12),它们通过不同的机制激活淋巴细胞、巨噬细胞等杀伤感染病毒的肝细胞,同时引起肝细胞的损伤和肝功能障碍。机体内存在着复杂的抗炎反应机制抑制过度的炎症反应对机体的损害。许多细胞因子具有抗炎作用,如白细胞介素-10(Interleukine-10,IL-10)和转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)等。炎症反应和抗炎反应的失衡、相互消长引起机体的免疫功能紊乱,导致机体抗肿瘤免疫功能降低,不能清除肿瘤细胞。炎症反应过程中产生的活性氧、NO等能够损伤肝细胞引起细胞发生基因突变形成肿瘤细胞IFN-γ是一种多功能细胞因子,在机体的抗感染、抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。诱导IFN-γ产生以增强NK细胞活性和Thl型细胞因子的分泌、增强具有抗肿瘤活性的细胞免疫的产生是肿瘤疫苗等免疫疗法发挥抗肿瘤效应的重要机制。在肝炎病毒感染过程中机体产生IFN-γ,但并不足以清除病毒。在慢性肝炎和HCC患者血液中也存在IFN-γ,肿瘤仍然发生和发展,提示在肝癌的发生发展过程中存在IFN-γ的分泌及其调节和功能障碍。大量的研究表明HCC患者血清IFN-γ水平降低是肝癌免疫逃逸的机制之一,但补充IFN-γ,甚至是大剂量IFN-γ并不能逆转免疫逃逸现象,提示IFN-γ在肝细胞癌发生发展过程中的作用是复杂的,肝癌细胞逃逸IFN-γ抗肿瘤的作用仍有待深入研究。本实验先以肝细胞癌、慢性乙型肝炎病人和健康献血员为研究对象,检测病人血清中IFN-γ等6种细胞因子的水平和免疫细胞亚群、乙型肝炎病毒的基因型并进行统计分析。结合病人的治疗分析接受经皮注射乙醇治疗后患者血清IFN-γ水平的变化与疗效的关系。在临床研究的基础上采用体外培养的人肝癌细胞系SMMC-7721研究了IFN-γ对肝癌细胞肿瘤抗原表达的影响,从分子水平上探讨IFN-γ在肝细胞肝癌免疫逃逸中的作用与机制。资料与方法：1.病例及样本的采集：2002年4月～2007年5月本院住院和门诊治疗的54例原发性肝细胞癌患者,其中男42例,女12例,年龄33～73岁,平均年龄58岁,经CT、MRI、AFP和(或)肝组织病理均证实为肝细胞癌,取样前未进行任何治疗。。2.主要实验方法：ELISA检测血清细胞因子：采用双抗体夹心法,一抗为生物素标记的抗IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12P70抗体,根据样品的OD值及曲线的斜率计算出细胞因子的含量。采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法(APAAP)检测外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞的百分率。银染法检测T淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白,流式细胞仪测定肝细胞癌患者外周血粘附单个核细胞CD83及HLA-DR表达。实时荧光定量PCR检测血清HBV-DNA含量和HBV基因型。四氮唑(MTT)比色法检测人肝癌细胞增殖活性。用全自动生物化学检测仪测定及配套检测试剂盒检测体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞培养上清和细胞匀浆中γ-GT、ALT、AST活性。间接免疫荧光检测人肝癌SMMC-7721细胞株MAGE-1表达。采用双抗体夹心ELISA法检测γ-干扰素处理的人肝癌SMMC-7721细胞株AFP表达。应用亚硫酸氢盐修饰后PCR测序法(Bisulfite Sequencing PCR, BSP)检测γ-干扰素处理的人肝癌SMMC-7721细胞株MAGE-1基因启动子甲基化状态的变化,采用免疫沉淀检测γ-干扰素处理的人肝癌SMMC-7721细胞株c-Jun氨基端激酶活性的影响。3.统计学方法：计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,采用t检验,计数资料用χ2检验(或连续性校正法),数据分析采用SPSS Version 12,p<0.05为统计学上有显著差异。结果：1.外周血细胞因子谱型的变化：HCC病人血清IFN-γ含量为4.92±2.15pg/ml,低于健康献血员(19.16±2.34 pg/ml)和慢性乙型肝炎病人(11.42±6.86 pg/ml)(P<0.05),IL-2、IL-12P70含量降低,而TNF-α、TGF-β1、IL-4、IL-10含量增高。根据肝癌体积大小对病人分组比较血清IFN-γ水平,发现随着肿瘤体增大,血清IFN-γ水平下降,调节IFN-γ分泌的IL-12P70水平与IFN-γ的变化趋势是一致的,但病人血液中都存在IFN-γ。根据甲胎蛋白的水平将未经治疗的病人病人分成2组,结果提示甲胎蛋白含量高时血清IFN-γ水平下降,调节IFN-γ分泌的IL-12P70水平与IFN-γ的变化趋势是一致的。2.外周血细胞亚群的变化：与慢性乙型肝炎病人和健康献血员相比HCC病人CD4+T淋巴细胞、CD4+/CD8+比值降低,反映T淋巴细胞增殖活性的AgNORs降低。黏附细胞悬液CD83和HLA-DR表达降低。3.乙型肝炎病毒基因型与IFN-γ浓度的关系：采用实时定量PCR检测慢性乙肝病毒携带者、慢性乙型肝炎病人和HCC病人感染的乙肝病毒基因型并分组,比较血清IFN-γ含量。结果表明感染C基因型乙肝病毒HCC病人血清IFN-γ含量低于感染B基因型乙肝病毒者的HCC病人,IFN-γ的含量分别为6.69±2.11和4.36±1.08 pg/ml,(P<0.05)。乙型肝炎患者的变化类似,但不同基因型乙型肝炎病毒携带者之间,IFN-γ的含量无差异。4.经皮乙醇注射(PEI)可导致肝癌细胞坏死从而减少肝癌细胞数,坏死的瘤体形成自身瘤苗可以诱导机体产生抗肝癌免疫反应。PEI治疗后病人肿瘤体积缩小,AFP含量降低而IFN-γ水平增加。5.采用不同浓度IFN-γ处理人肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721,结果表明IFN-γ对SMMC-7721细胞的增殖有抑制作用,浓度为512U/ml时抑制率为19.4±2.7%,培养上清中AFP含量为0.18±0.03ng/ml,细胞匀浆AFP含量为0.73±0.04ng/ml,仅用全培基培养的SMMC-7721培养上清的AFP含量为0.74±0.05 ng/ml,细胞匀浆AFP含量为0.79±0.07 ng/ml,提示在IFN-γ作用下SMMC-7721细胞AFP表达量下降,ALT、AST和γ-GT活性变化无统计学差异。在IFN-Y作用48h之后512U/ml组SMMC-7721细胞MAGE-1表达下降、MAGE-1基因启动子甲基化程度增加、JNK活性减低。结论肝癌的免疫逃逸是成功的肝癌免疫治疗必须克服的严重障碍。造成肝癌的免疫逃逸的机制是多方面的,包括慢性病毒性肝炎时体内的慢性炎症环境、肝炎病毒逃逸免疫攻击、抗凋亡效应及肿瘤细胞产生的免疫抑制因子、抗原调变等。本研究通过对肝癌病人和体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721的研究,分析探讨IFN-γ在肝癌免疫逃逸中的作用,得出以下结论：1.肝细胞癌病人细胞免疫功能低下,存在Th1向Th2免疫漂移现象,血清IFN-γ水平降低,而且肿瘤体积越大IFN-γ水平越低。2.感染C基因型乙肝病毒的慢性乙型肝炎病人易发生肝癌并且对干扰素反应差,本研究发现感染C基因型乙肝病毒的肝细胞肝癌和慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ水平低于感染B基因型乙肝病毒的病人,提示C基因型乙肝病毒可能使被感染的细胞逃逸IFN-γ诱导的抗肿瘤、抗病毒反应,可能是肝细胞癌的发生发展的重要机制。3.IFN-γ抑制甲胎蛋白的分泌和MAGE-1的表达,MAGE-1的表达的下调部分是由于MAGE-1基因启动子甲基化程度增加实现的,肿瘤细胞免疫原性降低,有助于肝癌细胞免疫逃逸。IFN-γ具有抗增殖和抗肿瘤的作用可能降低肝癌细胞的JNK活性通路。在肝细胞癌发生发展过程中IFN-γ的分泌及其功能和肿瘤细胞之间的关系可能是互为因果的。乙型肝炎病毒感染引起机体产生针对病毒的免疫反应,IFN-γ分泌增多,抑制肝炎病毒的复制、诱导产生抗肝炎病毒的细胞毒T淋巴细胞杀伤感染的细胞。增多的IFN-γ诱导具有免疫抑制作用和/或生长因子作用的细胞因子产生,这些反应有利于突变的细胞增长；IFN-γ下调甲胎蛋白和MAGE的表达,促进突变的细胞发生抗原调变,逃逸机体的免疫监视功能。而肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子进一步地改变细胞因子网络平衡。确切的机制有待深入研究。