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霉菌毒素在人类食品和动物饲料中无处不在。而在众多的霉菌毒素中,AFB1和ZEA被认为是是饲料和饲料原料中主要霉菌毒素污染物,它们不仅对动物健康造成损害,造成巨大的经济损失,而且还对人类生命安全也构成威胁。其中黄曲霉毒素B1(AFB1)是最致命的,它具有肝毒性、致畸性和致癌性。因此,被国际癌症研究机构(IARC)定为Ⅰ类致癌物。玉米赤霉烯酮(ZEA)具有类雌激素的作用,是雌激素强度的十分之一,它可以提高雌性动物的雌激素水平,从而引起动物的生殖生理和生殖器官的功能和形态发生变化,导致细胞毒性和遗传毒性。因此,食品和饲料中的霉菌毒素污染问题已经引起人们的广泛关注,但是人们对健康的评估往往局限于一种或一类霉菌毒素,而忽略了多种霉菌毒素之间的叠加、协同和拮抗作用,因此霉菌毒素对人类和动物健康的损害要比评估的严重得多。近些年来,生物降解霉菌毒素因为具有安全、有效、专一性强、可操作性强等特点,已经引起人们广泛关注。因此本试验首先通过体外优化组合,得到能同时降解AFB1和ZEA的由三种益生菌和霉菌毒素降解酶组成的霉菌毒素生物降解剂;然后在细胞水平上研究霉菌毒素生物降解剂对AFB1和ZEA引起的仔猪空肠上皮细胞损伤的保护作用;再通过仔猪动物饲养试验,研究霉菌毒素生物降解剂对AFB1和ZEA引起仔猪中毒的缓解作用;接着利用16S rDNA高通量测序技术对仔猪空肠和粪便中的微生物菌群丰富度和多样性进行分析;最后利用蛋白质组学技术对仔猪肝脏蛋白质变化及与霉菌毒素降解相关通路进行分析,为系统研究霉菌毒素生物降解剂对缓解AFB1和ZEA引起动物机体的毒性作用机制和降低AFB1和ZEA对仔猪健康和生长性能的影响提供参考依据。主要结果如下:(1)霉菌毒素生物降解剂的制备:通过响应面——中心组合试验设计,筛选优化同时降解AFB1和ZEA的益生菌组合最佳比例,然后与霉菌毒素降解酶进行配伍,得到同时降解AFB1和ZEA的霉菌毒素生物降解剂的最佳配比。试验结果表明单一枯草芽孢杆菌降解AFB1和ZEA的降解率分别是38.38%和42.18%(P<0.05)。但是,当枯草芽孢杆菌与干酪乳杆菌和产朊假丝酵母按照中心组合设计优化得出的比例1:1:1配伍后,对AFB1和ZEA两种毒素的降解率分别提高到45.49%和44.90%(P<0.05)。最后按照1:1:1配伍的三种益生菌与霉菌毒素降解酶按照3:2进行配伍,对AFB1和ZEA的降解率达到63.95%和73.51%(P<0.05)。试验结果表明,通过响应面中心组合试验设计获得同时降解AFB1和ZEA的霉菌毒素生物降解剂是可行的,为下一步试验奠定了基础。(2)AFB1和ZEA对仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)和小鼠肝细胞(AML12)的损伤作用:AFB1和ZEA对IPEC-J2和AML12小鼠肝实质细胞损伤不同,对IPEC-J2的细胞毒性:ZEA>AFB1,对AML12的细胞毒性:AFB1>ZEA。AFB1和ZEA对两种细胞的毒性存在时间和剂量依赖效应,而且在低浓度时,AFB1与ZEA之间存在协同作用(PAFB1×ZE<0.05)。当两种毒素(AFB1浓度为40μg/L,ZEA浓度为500 μg/L)同时作用于IPEC-J2细胞24 h时,对细胞毒性也表现为协同作用,为下一步试验建立细胞中毒模型奠定基础。(3)霉菌毒素生物降解剂对AFB1和ZEA诱导的仔猪肠上皮细胞危害的缓解作用:本试验采用复合益生菌的无菌体细胞上清液(CFSCP)和霉菌毒素降解酶(MDE)相结合,测定其对由AFB1和ZEA引起的IPEC-J2细胞毒性损伤的缓解作用。结果表明,AFB1与ZEA同时作用于细胞,具有抑制细胞活力的协同作用(P<0.05)。细胞活力随霉菌毒素浓度的增加而降低,并且随着反应时间的延长而增加(P<0.05)。加入40μg/L AFB1和500μg/L ZEA后,坏死细胞率显著提高(P<0.05),但加入可CFSCP+MDE可显著降低坏死细胞率并提高细胞的成活率(P<0.05)。加入CFSCP+MDE后显著降低与细胞凋亡、屏障功能和营养物质转运功能相关的基因Bax、GLUT2、ASCT2和IL6的相对mRNA丰度(P<0.05)。本研究为减轻霉菌毒素毒性提供了有效的研究方法,为保持肠道细胞的正常结构和功能提供参考依据。(4)霉菌毒素生物降解剂缓解仔猪AFB1和ZEA的中毒症状,该试验选择日龄为42±2日龄仔猪150头,按照体重随机分成五个组,每个组设3个重复,每个重复10头。对照组(A组)饲喂正常饲粮、B组(单独AFB1组)、C组(单独ZEA组)、D组(AFB1+ZEA组)和E组(AFB1+ZEA组+霉菌毒素生物降解剂),饲喂期60d。饲养试验结果表明,与单独含有AFB1和ZEA毒素组(负对照组)相比,添加霉菌毒素生物降解剂组仔猪平均日增重增加9.06%,腹泻率和死亡率分别下降了 54.30%和6.67%,母猪阴户面积下降24.97%,粗蛋白质消化率提高12.23%(P<0.05)。霉菌毒素生物降解剂显著降低了血液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶的含量(P<0.05),提高了仔猪粪便中淀粉酶活29.01%(P<0.05)。从肝脏、空肠和子宫组织形态学看,霉菌毒素生物降解剂对AFB1和ZEA引起的炎症反应有明显的缓解作用,使仔猪空肠绒毛高度和V/C比值分别增加了116.27%和104.84%(P<0.05)。免疫组化分析表明,与负对照组相比,霉菌毒素生物降解剂组子宫的Caspase-3阳性表达率降低了29.80%(P<0.05),NF-κB在肝脏和子宫中的阳性表达率分别降低了49.96%和8.71%(P<0.05)。霉菌毒素的代谢规律分析表明,与负对照组相比,霉菌毒素生物降解剂组血清、肝脏和肌肉中AFB1残留量分别降低了41.38%、51.43%和51.85%(P<0.05),肝脏和粪便中的ZEA残留量分别下降了 46.65%和28.83%(P<0.05),并使血清中内毒素含量有降低的趋势。霉菌毒素生物降解剂显著下调肝脏、空肠和子宫中细胞促凋亡因子Bax和Caspase-3(P<0.05),显著上调空肠和子宫中抑制细胞凋亡因子Bcl-2;与肠道上皮屏障功能相关的细胞因子ZO-1和Occludin在空肠和子宫中均显著上调(P<0.05),但在肝脏中ZO-1显著上调(P<0.05),而Occludin显著下调(P<0.05)。与营养转运相关的细胞因子的研究表明,霉菌毒素生物降解组空肠中PepT1和GLUT2显著上调(P<0.05),ASCT2和SGLT1显著下调(P<0.05);肝脏中ASCT2和 GLUT2 显著上调(P<0.05),SGLT1显著下调(P<0.05);子宫中 PepT1、ASCT2 和 GLUT2均显著上调(P<0.05),而SGLT1在各组间差异不显著(P<0.05)。细胞炎性因子的分析表明,与负对照组相比,霉菌毒素生物降解剂组空肠中炎性因子IL10、IL8、IL1β和TNF-α表达量下调(P<0.05),而IL6则上调(P<0.05);肝脏中IL10和IL8的表达量上调(P<0.05);卵巢中IL10的表达量下调(P<0.05),而IL6和IL8则出现则表现为上调(P<0.05)。总体而言,霉菌毒素生物降解组的大部分炎性因子的mRNA丰度变化与负对照组差异较大,但与对照组趋于一致,说明霉菌毒素生物降解剂具有缓解霉菌毒素的危害,可使空肠、肝脏和子宫的功能恢复正常。(5)利用微生物宏基因学研究霉菌毒素生物降解剂对仔猪胃肠道微生物区系的影响:通过16S rDNA高通量测序技术对仔猪空肠和粪便中微生物区系进行研究,结果表明霉菌毒素生物降解剂显著提高空肠微生物的丰富度Sobs指数和多样性(Shannon指数)(P<0.05),而对仔猪粪便中的丰富度和多样性影响不明显。仔猪空肠内容物和粪样中菌群受到AFB1和ZEA的显著影响,在仔猪空肠内容物微生物门水平上,霉菌毒素生物降解剂分别使拟杆菌门(Bacteridetes)、放线菌门(Actinobacteria)、糖化细菌门(Saccharibacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)增加了 4.99、4.64、13和6.5倍(P<0.05),调节AFB1和ZEA诱导的肠道失衡态微生物区系恢复到正常水平。在仔猪粪便微生物门水平上,霉菌毒素生物降解剂分别显著降低螺旋体门(Spirochaetae)菌群数量 60.98%(P<0.05)和黏胶球形菌门(Lentisphaerae)45.61%。在仔猪空肠内容物微生物属水平上,霉菌毒素生物降解剂使有益菌乳酸菌属(Lactobacillus)显著增加了 1.34倍(P<0.05),而使狭义梭菌属(Clostridiumsensustricto1)降低了 38.66%。在仔猪粪便微生物属水平上,霉菌毒素生物降解剂使有益菌乳酸杆菌属(Lactobacillus)增加了 4.23倍,使普雷沃氏菌属9(Prevotella9)显著增加了 4.90倍(P<0.05),而使理研菌科RC9肠道家族(RikenellaceaeRC9gutgroup)降低53.41%。霉菌毒素生物降解剂可以通过增加有益菌(Lactobacillus和Prevotella9)的比例,降低有害菌狭义梭菌属(Clostridiumsensustricto1)比例,维持肠道菌群平衡、保证肠道健康、促进仔猪生长。(6)利用蛋白质组学研究仔猪肝脏对霉菌毒素解毒的分子机制:通过高通量、非标记的DIA蛋白质组学技术,分析霉菌毒素生物降解剂对缓解AFB1和ZEA对仔猪肝脏蛋白表达谱的变化。按照P<0.05、差异倍数大于1.5倍或小于0.67倍的阈值筛选出仔猪肝脏的208个差异表达蛋白,其中153个蛋白表达上调,55个蛋白表达下调。这些差异蛋白主要参与8个细胞组件、11个分子和18个生物进程。从这些差异蛋白中选择与药物代谢、丁酸代谢和外源物质代谢通路相关的CYP2E1、HMGCL、ABAT、AOX1、MAOB、ACM4、ALDH5A1、ADH1-7、HK3和GSTZ1等10个蛋白进行转录水平验证,除HK3和GSTZ1两个蛋白外,其余有8个蛋白的qRT-PCR结果与DIA结果一致,说明蛋白质组学数据可靠。深入对肝脏表达的10个差异蛋白与仔猪空肠微生物区系、仔猪平均日增重、AFB1和ZEA在仔猪血清、肝脏和肌肉中的残留量进行皮尔森相关性分析,结果表明AFB1和ZEA在仔猪血清、肝脏中的残留量与HK3蛋白表达以及有害菌属狭义梭菌属(Clostridiumsensustricto1)和弯曲杆菌属(Campylobacter)的丰度成正相关关系,揭示了霉菌毒素生物降解剂缓解AFB1和ZEA毒性的分子机制。