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四氢嘧啶是一种天然存在的相容性溶质,它存在于许多不同种类的微生物中。它既可以调节微生物胞内外渗透压平衡,又可以稳定酶活性、保护细胞抵抗外界极端环境(冻融、干燥、电离辐射、高温等),还可以作为氧化剂防止细胞膜功能受损,并且可以用于治疗神经退行性疾病。由于其具有优良的保护特性,四氢嘧啶在生物技术、皮肤护理、生物医药等行业市场前景非常广阔。实验室前期构建了一株大肠杆菌四氢嘧啶工程菌ECT01(Escherichia coli W3110 ybeM::PT7-ectABC,tyrR::PT7-ectABC),此菌株存在糖酸转化率低、代谢网络不够完善等问题。为了解决上述问题,本文通过CRISPRi技术干扰合成代谢基因表达,进一步提高了四氢嘧啶生产菌的转化率和产量。本研究完成了以下工作:1、为了提高四氢嘧啶产量及转化率,利用CRISPRi技术干扰合成代谢基因表达。首先将dcas9基因(表达dCas9蛋白,结合于靶位点干扰基因转录表达)整合至基因组yncI位点。由于菌株ECT01中使用PxylF,故将dcas9基因受控于PxylF,构建了菌株ECT02(ECT01,yncI::PxylF-dcas9)。靶基因为aceE和zwf基因,干扰位点分别为基因启动子-35区、基因ATG区域和基因尾部。以ECT02为出发菌,构建aceE干扰菌株ECT03-1/2/3和zwf干扰菌株ECT04-1/2/3。摇瓶发酵结果显示ECT03-1/2/3和ECT04-1/2/3产量较不干扰菌株ECT02-K(ECT02,pGRB空质粒)分别降低37.7%、8.4%、4.2%和59.3%、27.5%、2.9%。另外,荧光定量PCR结果显示出,在不添加木糖的情况下,基因转录量降低程度与添加木糖时几乎一样,即木糖启动子不严谨。这就导致dCas9蛋白过早表达,影响菌体生长代谢。2、为了更准确地干扰合成代谢基因表达,本研究在3种启动子(Ptet、Para、Prha)中筛选严谨性更好的启动子。在菌株ECT01中,四氢嘧啶合成酶基因受控于T7启动子,T7启动子启动转录需要T7 RNA聚合酶参与,而T7RNAP基因受控于PxylF。因此本研究将T7RNAP基因启动子替换为上述三种启动子,摇瓶发酵时在不添加诱导剂的情况下,通过检测四氢嘧啶产量即可确定各启动子严谨性。以ECT01为出发菌,构建菌株ECT05-07(依次替换为Ptet、Para、Prha)。摇瓶发酵结果显示在无诱导剂时,菌株ECT06中四氢嘧啶产量为0.27±0.03 g/L;在添加诱导剂时其产量为11.88±0.89 g/L。由实验结果看出,Para严谨性好且菌株中四氢嘧啶积累量最高,因此确定Para最适合用于干扰实验。3、将dcas9基因由Para控制整合至基因组yncI位点,构建菌株ECT08(ECT06,yncI::Para-dcas9)。以 ECT08 为出发菌,对基因 zwf、aceE、gltA、pfkA、pykF、sucA和sucCD进行干扰,干扰位置定为基因ATG区域和基因中部,构建干扰菌株ECT09-15。摇瓶发酵结果显示干扰基因ATG区域和基因中部效果几乎一致。以干扰基因中部为例进行说明,干扰aceE和sucA基因四氢嘧啶产量分别为14.12±0.15 g/L和12.83±0.24 g/L,较 ECT08-K 产量 11.66±0.16 g/L 分别提高 21.1%和 10.0%;干扰sucCD基因四氢嘧啶产量与ECT08-K相差不大;干扰zwf gltA、pfkA和pykF基因四氢嘧啶产量较ECT08-K分别降低38.2%、26.8%、25.8%和5.8%。最终筛选出正向效果最显著的菌株为干扰aceE基因中部的生产菌,产量达到14.12 g/L,较出发菌提高21.1%;糖酸转化率达到31.4%,较出发菌转化率25.9%提高21.2%。4、为了克服质粒系统不稳定、菌体负担重等缺点,以ECT08为出发菌,将用于干扰aceE基因中部的sgRNA整合到基因组xyIA位点。选用四种不同强度的启动子(PT7、Ptrc、Para和PJ23119)控制其转录,构建菌株ECT16-19。摇瓶发酵结果显示四氢嘧啶积累量分别为12.44 g/L、11.17 g/L、4.38 g/L和11.21 g/L,其中ECT16较出发菌ECT08(11.75±0.18 g/L)提高 5.8%,ECT17-19 较 ECT08 分别降低 4.9%、62.7%和4.5%。