柑橘采后在贮藏、运输和销售的过程中极易因为机械损伤而引起病原微生物侵染,造成严重的资源浪费和经济损失,况且大多数侵染的病原微生物能够产生毒素,引起食品安全问题,危害人类的健康。天然防腐剂与传统化学防腐剂相比,尤其是天然抑菌肽由于其广谱抗菌性、不易产生耐药性以及安全无毒等优点成为食品防腐、医疗保健等行业的研究热点。螺旋藻由于生长速度快、生物量大以及含有丰富的蛋白质等优点,成为生物活性肽提取分离的优质来源。本项研究以螺旋藻干粉为原料,通过酶解的方法制备螺旋藻多肽,并分离纯化抗柑橘腐败真菌的多肽组分,并对其进行分析和鉴定,主要研究结果如下:(1)从不同发病症状的柑橘中分离出五种不同的腐败真菌,通过传统形态学观察和rDNA-ITS序列分析相结合的方法确定这五种腐败真菌菌株分别为指状青霉Penicillium digitatum、扩展青霉 Penicillium expansum、光抱青霉 Penicillium glabrum、深绿木霉Trichoderma atroviride和黄曲霉Aspergillus flavus。(2)以螺旋藻干粉为原料,采用反复冻融和超声破碎相结合的方法进行螺旋藻蛋白的提取。通过甲醛滴定法、茚三酮比色法、邻苯二甲醛法和三氯乙酸沉淀法四种不同水解度测定方法的比较,确定选用邻苯二甲醛法进行螺旋藻蛋白酶解液水解度的测定。通过单酶解和双酶解水解度的对比发现,采用先碱性蛋白酶后木瓜蛋白酶的双酶解方法能够提高螺旋藻酶解液的水解度,即高达42.19%;通过L9(34)正交试验确定了碱性蛋白酶的最优条件是温度55℃,pH 8.5,酶与底物比(E/S)3%时,水解度为38.97%;木瓜蛋白酶的最优条件是温度65℃,pH 5.5,E/S 5%,水解度为32.01%。与此同时,本实验还确定了胃蛋白酶的最优条件是温度40℃,pH 1.5,E/S 5%时,水解度为24.54%;胰蛋白酶的最优条件是温度45℃,pH 6.5,E/S 3%,水解度为26.08%,可以将其应用于其他蛋白酶解的研究中。(3)螺旋藻酶解液经超滤获得<3KD、3-5KD、5-10KD和>10KD四个不同分子段多肽组,对意大利青霉菌、指状青霉、深绿木霉和黄曲霉的抗真菌活性表现为多肽组分分子量越小,抗真菌活性越强,即<3KD分子段的多肽组分表现出最强的抗真菌活性。选择<3KD的多肽组分进行葡聚糖Sephadex G-25柱层析分离纯化,洗脱条件是:上样体积为2mL,流速为1mL/min,检测波长为280nm,洗脱液为0.O1mol/mLTris-Hcl缓冲溶液,层析柱柱参数为1.6×40cm。按照出峰顺序进行洗脱液的收集,共收集到两个峰,分别命名为组分A和组分B。以意大利青霉菌、指状青霉、深绿木霉和黄曲霉为供试菌,结果表明,组分B表现出较强的抗真菌活性,其对这四种供试菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为6.25、3.13、12.50和12.50mg/mL。(4)采用串联质谱LC-MS/MS对螺旋藻抗真菌肽组分B进行一级结构测定,通过uniprot蛋白数据库检索确定了四个能够找到已被鉴定且可信度高的蛋白质来源的唯一肽段,分别为 RGQGGICY、AKALTEETG、KPTPLCTEFVA 和 SVAVGVGKM,这四个唯一肽段在螺旋藻抗真菌多肽组分B发挥抗真菌活性时均起到了一定的作用。最后,根据C-藻蓝蛋白的生理活性以及抗菌肽发挥抗菌作用所具备的典型结构特征确定了螺旋藻抗真菌多肽组分B中起主要抗真菌活性作用的多肽为SP-4,分子量为629.40Da,氨基酸序列为SVAVGVGKM,对应C-藻蓝蛋白β亚基N端第126-135个氨基酸残基,该结果为后续研究和应用奠定了重要的基础。