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干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，通过细胞增殖、移行、分化和成熟的严格调控等一系列连锁反应，分化成各类前体细胞，最终导致成人机体大多数组织细胞的产生和更新。到目前为止，除了造血干细胞、肠道干细胞以外，还发现了很多成体干细胞，如神经干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞等。体内外实验已经证明，从骨髓基质中分离的多能干细胞--人骨髓间充质干细胞(hMSCS)可产生多种间充质组织的前体细胞，包括骨、软骨、肌腱、脂肪、肌肉和造血支持基质。但最近人们也分别从脐血、外周血、骨和小梁骨、脂肪组织、滑膜组织、胰腺组织等分离出hMSCS，并证明了它们向其它胚层分化的能力。本研究的目的是分析间充质干细胞和内皮细胞的基因表达差异，探讨体外基因转染诱导hMSCS内皮分化的可行性。首先采用0.1%Ⅰ型胶原酶和0.25%胰酶混合消化脐静脉，高效快速获得大量高纯度脐静脉内皮细胞（hUVECs），传代次数少，细胞基因变异小，为进行大规模基因分析提供可靠的样本来源。采用密度梯度离心和贴壁筛选联合使用的方法，获得高同源性的hMSCS细胞群。通过高密度接种和低比例传代培养细胞，保持细胞的均质性、未分化状态和高度可塑性。免疫细胞化学技术、免疫荧光和FACS等从蛋白水平上鉴定了hMSCS和hUVECS的纯度，证明了hMSCS向内皮细胞分化的细胞免疫学基础。透射电镜从超微结构上观察了两者的差异，基因表达谱芯片则进一步从基因表达水平<WP=60>比较了两者的表达差异，揭示了hMSCS向内皮细胞分化的分子基础，为我们进行体外基因转染诱导hMSCS向内皮分化实验提供了参考。用脂质体转染法将含目的基因VEGF165的真核表达质粒pcDNA3.1/GS转染hMSCS，进行诱导、扩增培养及内皮分化表型检测。结果如下： 1.胰酶-胶原酶混合消化法获取脐静脉内皮细胞纯度高，数量大。2.原始hMSCS表达早期内皮细胞分化标志和内皮前体细胞标志之一KDR/Flk-1,与早期内皮细胞发育相关。3.表达谱芯片检测可见约84%的基因在hMSCS和hUVECS中表达无明显差异。hMSCS表达多种内皮细胞早期分化的其它标志，如ICAM-1、VCAM-1，以及内皮细胞分化相关因子1(EDF1)、微血管内皮细胞分化相关基因1 (MDG1)、内皮分化鞘磷脂G-蛋白偶联受体2(EDG2)等。4. hUVECS高表达CXCRF、VEGF、CTNNB1和Ang-2等344个基因，其中信号分子和转导蛋白比例最大，多种基因的表达和功能受VEGF调控。5.转染后hMSCS形态上，部分细胞胞体变短，突起增多，由原本的长梭形变成多角形或不规则形，向内皮细胞形态靠近。6.在免疫表型上也有内皮细胞分化的趋势。RT-PCR显示靶细胞中有VEGF165和Flt-1 mRNA的表达，并且Flk-1/KDR表达显著增强。7.免疫荧光和ELISA检测表明了VEGF165蛋白的瞬时表达，并且分泌到细胞外。8.FACS结果显示，转染的 hMSCS CD44表达显著下调，CD31，Flk-1则明显上调，CD34、FⅧAg的表达也有不同程度的升高。近来人们研究骨髓基质的兴趣增加，从成人髂嵴穿刺的骨髓中分离出与成纤维样克隆形成单位(CFU-F)相似的细胞群，称之为MSCS。MSCS是一个异质细胞群，不同于CFU-F，它具有广泛的自我更新和分化潜能，虽然目前还未形成MSCS表型特征的一致意见但MSCS表达一系列表面抗原，通过MSCS<WP=61>表达的一系列表面抗原相关单克隆抗体就可进行表型鉴定。间充质干细胞是多能性的,在特定转录因子的诱导下可向不同的方向分化。如在肌特异性转录因子MyoD的作用下间充质干细胞分化为肌细胞系,在过氧化物酶体增生物激活受体γ2 (PPARγ2) 的作用下则分化为脂肪细胞系,而核心结合因子α1 (Cbfa1)基因是则骨形成的关键基因。体内实验已经证明了MSCS向内皮细胞直接转化的可能性,将足够数量的MSCS注入人体后，可促进缺血性疾病缺血部位的血管重建，参与创伤部位的血管修复和血管壁的构成，但分化机制和诱导条件目前尚未阐明，我们推测在间充质干细胞向内皮细胞系的分化过程中存在一种内皮细胞特异性的转录因子来决定这一分化过程。本研究中，我们用cDNA芯片分析了hMSCS和内皮细胞的基因表达差异，探索了hMSCS内皮分化的分子基础和转化机制，进行了VEGF165体外基因转染诱导hMSCS内皮分化的尝试，以促进hMSCs作为血管组织工程的候选种子细胞和遗传性、缺血性疾病的临床治疗中的应用。实验结果我们发现，约84%的基因表达在间充质干细胞和内皮细胞间无明显差异，而且hMSCS表达多种内皮细胞特异性mRNA。VEGF165基因转染后RT-PCR有明显条带，免疫荧光显示该蛋白表达强阳性。经FACS、免疫细胞化学和免疫荧光技术分析可见未转染hMSCS CD44表达强阳性，FACS峰度高, CD31、CD34和CD45表达阴性,而VEGF165转染后hMSCS CD44表达明显下调，CD31则明显上调，CD34，FⅧAg和 Flt-1的表达也有不同程度升高。这和多方面的原因有关。VEGF与细胞膜上的受体结合，通过一系列细胞内信号系统，特别是MAPK的活动发挥作用，从而促进细胞内PECAM-1(CD31)、CD34、 FⅧAg的表达和释放,反馈性上调Flk-1/KDR的表达。Flt-1的表达可能与上游启动子在特定环境作用下转录增强有关，但机制不明。总之，转染后的hMSCS已经具备内皮细胞相关表型，可能是间充质干细胞和内皮细胞之间的