鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属球虫引起的急性流行性寄生原虫病,该病分布广泛,是严重危害养鸡业发展的重大疾病之一,临床多以柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）和巨型艾美耳球虫（E.maxima）四种常见且多为混合感染。目前鸡球虫病的防控措施主要有药物和活卵囊疫苗预防,活疫苗存在毒力返祖和散毒等风险,并且制作工艺复杂、成本较高等问题,因此亟需研制一种安全稳定的新型疫苗。运用现代生物技术构建的基因工程疫苗具有安全性好、不存在返祖现象、成本低廉等优点已被广泛关注。近年来,众多学者致力于鸡球虫基因工程疫苗的开发,但国内尚无商品化基因工程疫苗投放市场。而且临床上的鸡球虫病大多是由几种球虫混合感染引起的,所以只能抵抗单一球虫的疫苗远远不能满足鸡球虫病防控需求,市场需要的是能够抵抗多种球虫混合感染的安全疫苗。研究基因工程疫苗的关键是筛选保护性抗原基因。鸡球虫在子孢子、裂殖生殖和配子生殖阶段的保护性抗原均具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生保护性免疫应答。目前进行球虫基因表达的载体系统主要有大肠杆菌、枯草杆菌、卡介苗、乳酸菌和酵母等,其中毕赤酵母表达系统具有基因操作简单、发酵生长速度快、外源基因蛋白表达量高、成本低廉等优点,被人们广泛关注。针对单一或多种球虫的基因工程疫苗已有报道,将不同球虫基因重组后可预防多种球虫感染,且可减化其生产工艺。研究表明利用大肠杆菌系统表达的多价重组疫苗和核酸疫苗均具有一定的免疫保护效果,而将不同的鸡球虫基因串联利用毕赤酵母系统表达制备四价重组亚单位疫苗的研究尚未见报道。因此,本研究将球虫在子孢子和裂殖生殖阶段免疫保护效果较好的Et TA4基因、Ea3-1E基因、Em IMP1基因和En NA4基因进行PCR扩增,并把四个基因通过GS Linker进行串联（命名为TEIN）后插入毕赤酵母p PIC9K表达载体,用毕赤酵母GS115菌株进行诱导表达,同时用大肠杆菌表达系统做对照。分别将诱导纯化的重组蛋白制备亚单位疫苗免疫14日龄雏鸡,通过分析抗球虫指数ACI、最适免疫剂量、免疫持续期和保存期及其安全性指标对疫苗进行综合评价。具体研究内容如下:不同鸡球虫基因在毕赤酵母和大肠杆菌系统的表达:分别以柔嫩艾美耳球虫c DNA为模板扩增TA4基因、以堆型艾美耳球虫c DNA为模板扩增3-1E基因、以巨型艾美耳球虫c DNA为模板扩增IMP1基因、以毒害艾美耳球虫c DNA为模板扩增NA4基因,然后将四个基因通过GS Linker串联（命名为TEIN）,构建毕赤酵母重组质粒p PIC9K-TA4、p PIC9K-NA4、p PIC9K-3-1E、p PIC9K-IMP1、p PIC9K-TEIN并转化至GS115感受态后用BMGY和BMMY培养基进行诱导表达;构建大肠杆菌重组质粒p ET32a-TA4、p ET32a-NA4、p ET32a-3-1E、p ET32a-IMP1、p ET32a-TEIN转入BL21感受态细胞后利用IPTG诱导表达用作对照。结果表明,成功扩增得到Et TA4（540bp）、Ea3-1E（510bp）、Em IMP1（1128bp）、En NA4（543bp）四个基因片段和串联基因TEIN（2900bp）。通过SDS-PAGE鉴定其目的蛋白大小分别为20 KD、19 KD、42 KD、20 KD和101 KD（不包括载体标签）。Western blot结果显示,所有重组蛋白均具有良好的反应原性。鸡球虫四价重组亚单位疫苗最适免疫剂量的确定:于14日龄分别按高（150μg/羽）、中（100μg/羽）、低（50μg/羽）三个剂量组腿部肌肉注射TEIN重组蛋白,21日龄按相同剂量加强免疫,28日龄以1×10~4个/羽灌服不同球虫孢子化卵囊。通过对存活率、相对增重率、肠道病变计分、OPG综合评价抗球虫指数ACI;通过间接ELISA方法检测血清中特异性抗体Ig G、细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ水平;流式细胞仪测定脾脏T淋巴细胞数量等各项指标。结果表明,中剂量组（100μg/羽）加强免疫后Ig G抗体滴度与首免相比差异显著（p＜0.05）;高、中、低三个剂量组IL-2水平在加强免疫后较首免上升显著（p＜0.05）,中剂量组在二免后IL-2滴度可达380 pg/ml;各剂量组IL-10水平于加强免疫后变化不明显（p＞0.05）;不同剂量组IFN-γ水平以100μg/羽免疫后滴度最高,可达314 pg/m L;三个剂量组首免、加强免疫后CD4+和CD8+T淋巴细胞所占比例较对照组差异显著（p＜0.05）,中剂量组CD4+T淋巴细胞比例于加强免疫后较首免差异显著（p＜0.05）;所有试验组中以中剂量组（100μg/羽）抗毒害艾美耳球虫ACI最高达180.61。因此将100μg/羽做为四价重组亚单位疫苗的最适免疫剂量,为后续进行免疫保护效果研究奠定基础。鸡球虫四价重组亚单位疫苗免疫保护性研究:将制备的重组蛋白分别与氢氧化铝佐剂按1:1比例混匀后制备亚单位疫苗,按100μg/羽免疫剂量腿部肌肉接种14日龄雏鸡。蛋白免疫组分为毕赤酵母表达蛋白混合免疫和四价串联组、大肠杆菌表达蛋白混合免疫和四价串联组,同时用活卵囊疫苗做对照。免疫程序分为单次免疫和加强免疫。单次免疫实验组于14日龄按100μg/羽腿部肌肉注射重组亚单位疫苗,21日龄除PBS组外,其余各组分别按1×10~4个/羽灌服不同球虫孢子化卵囊。加强免疫组于14、21日龄分别按100μg/羽腿部肌肉注射重组亚单位疫苗,28日龄攻虫。所有试验组均于35日龄每组随机取5只剖杀,逐只进行肠道病变计分和卵囊计数。结果表明,加强免疫组在降低肠道病变、提高增重和抗球虫指数方面与单次免疫组相比差异显著（p＜0.05）,单次免疫组ACI大部分介于150和161之间,而加强免疫组均在160和181之间;综合比较ACI发现毕赤酵母与大肠杆菌系统表达的TEIN蛋白相比差异显著（p＜0.05）;加强免疫后抵抗球虫感染时毕赤酵母表达的四价重组TEIN蛋白与混合蛋白免疫组相比差异显著（p＜0.05）,其中毕赤酵母四价串联重组蛋白抗毒害艾美耳球虫ACI为180.61,毕赤酵母混合蛋白抗堆型艾美耳球虫ACI为160.60。鸡球虫四价重组亚单位疫苗安全性评价:将雏鸡随机分为1日龄单剂量一次免疫组（100μg/羽）、单剂量三次免疫组（100μg/羽）和三倍单剂量一次免疫组（300μg/羽）。通过观察雏鸡接种后的临床症状,检测血常规和血液生化指标,主要内脏器官有无明显病理变化综合评价疫苗的安全性。结果表明,所有鸡只接种疫苗后不会产生明显的临床反应;血常规和血液生化检测发现TEIN重组亚单位疫苗对雏鸡血液指标影响不显著（p＞0.05）;主要脏器经HE染色后未发现明显病理组织学变化,说明该疫苗对受试动物相对安全。鸡球虫四价重组亚单位疫苗免疫持续期和保存期测定:通过分析雏鸡在免疫后21 d、35 d和49 d抗球虫指数（ACI）、血清中Ig G抗体滴度、IL-2、IL-10和IFN-γ细胞因子水平、脾脏T淋巴细胞数量的变化测定重组TEIN疫苗的免疫持续期。针对疫苗存放于4℃、室温和-20℃不同条件下的物理性状、免疫保护效果及稳定性进行评估,以此来测定其有效保存期。结果表明,重组TEIN亚单位疫苗在免疫后第49 d时ACI为160.12;Ig G、IL-2、IL-10和IFN-γ水平均明显高于对照组（p＜0.05）,脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞数量与对照组相比差异显著（p＜0.05）。以上结果初步说明该疫苗的免疫持续期可以维持到免疫后49 d。当四价重组亚单位疫苗存放于4℃、保存期为180 d时仍具有一定的免疫保护效果。综上所述,本研究成功在毕赤酵母和大肠杆菌系统表达了由柔嫩艾美耳球虫TA4、堆型艾美耳球虫3-1E、巨型艾美耳球虫IMP1和毒害艾美耳球虫NA4基因通过GS Linker串联的TEIN基因,在此基础上制备了鸡球虫四价重组TEIN亚单位疫苗。通过免疫保护性试验发现其最适免疫剂量为100μg/羽,综合比较ACI发现毕赤酵母系统表达的蛋白优于大肠杆菌表达系统,四价重组蛋白优于混合蛋白免疫,加强免疫优于单次免疫效果。安全性评价结果表明该疫苗免疫动物后血液指标和主要脏器未见异常,疫苗免疫持续期至少达49天以上,将疫苗于4℃保存180天仍具有较好的免疫保护作用。为下一步鸡球虫基因工程疫苗的临床应用奠定了良好基础。